单克隆抗体制备的技术.ppt

,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单克隆抗体制备的技术,单克隆抗体制备的技术单克隆抗体制备的技术,基本概念,抗原决定镞（抗原表位）,细胞克隆,多克隆抗体,单克隆抗体,Antigenic determinant,是指抗原分子中决定抗原特异性的,特殊化学基团，又称表位(,epitope).,细胞克隆：,由一个细胞增殖而成的细胞集团,Polyclonal antibody,PcAb：,针对多种抗原决定簇的混合抗体,Monoclonal antibody,McAb:,由单个,B,细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体,Ab1,Ab3,Ab4,单克隆抗体,抗原,Ab1,抗血清,Ab1,Ab2,Ab3,Ab4,Ab2,Ab3,Ab4,普通抗血清（多克隆抗体）,脾,B,细胞,骨髓瘤小鼠取腹水,骨髓瘤细胞,HAT,培养，稀释,单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图,杂交瘤细胞,+PEG,融合,Ab2,杂交瘤技术的理论基础,淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体,细胞融合,技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性,利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备,McAb,当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（,hybrid cell）。,细胞,DNA,合成途经,1.替代途径：次黄嘌呤（,H）,HGPRT,2.主要途径：,氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸,谷 氨 酰 胺 （,A-）,尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸,TK,3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（,T）,HAT,选择培养基的原理,HAT,选择培养基组分,次黄嘌呤（,hypoxanthine,H),氨甲喋呤（,aminopterin,A):,叶酸拮抗剂,胸腺嘧啶核苷（,thymidine,T),脾,抗原免疫的脾细胞,(B,细胞,),小鼠骨髓瘤细胞,(B,细胞恶性肿瘤,),1.,抗体分秘,(IgG+)1.,具永生性,2.HGPRT+,在,HAT,生长,2.8AG,筛选出,HGPTP-,株,PEG,融合,HAT,筛选,脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）,（,HGPRT+、Ig+）,融合的结果及命运,杂交瘤细胞,未融合的脾细胞,未融合的骨髓瘤细胞,脾-脾杂交细胞,骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞,免疫动物 培养骨髓瘤细胞,收集致敏的,B,淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞,细胞融合,HAT,选择培养基筛选杂交瘤细胞,检测筛选阳性细胞,克隆化培养（反复3-5次）,获得稳定分泌,McAb,的杂交瘤细胞株,McAb,的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）,McAb,纯化及鉴定,制备单克隆抗体的基本技术,1,抗原提纯与动物免疫,2,骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备,3,细胞融合,4,抗体检测,5,杂交瘤的克隆化和冻存,6,McAB,的制备,7,单克隆抗体的纯化,免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性,B,细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。,可溶性抗原10-15,ug/100ul+,等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次,),冲击免疫（融合前3天进行）,选用6-12周龄,Balb/c,小鼠,颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果,可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。,骨髓瘤细胞系选择要点：,稳定易培养、自身不分泌,Ig、,融合率高、,HGPRT,缺陷株,常用骨髓瘤细胞系：,NS1、SP20、X63,等。,保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）,防止支原体污染（胎牛血清）,融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95,融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞,饲养细胞一般在融合前一天制备,免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中,B,淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。,融合比例：,骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10,融合剂：40%,PEG（,分子量1000-2000）,融合24小时后加,HAT,培养液 2周后 改用,HT,培养液2周后,改用一般培养液,一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。,可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。,克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。,克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次,克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法,阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染,单抗生产的方法：,动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。,单抗纯化方法：,盐析,凝胶过滤,离子交换层析,亲和层析法,辛酸沉淀法,用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。,血清,50%饱和度硫酸胺,上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）,33%饱和度硫酸胺,上清 沉淀,拟球蛋白,r,球蛋白,凝胶过滤法,干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。,交联葡聚糖凝胶(,Sephadex),琼脂糖凝胶(,Sepharose),离子交换层析法,DEAE,纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂,CM,纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂,亲和层析法,将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。,A,蛋白-,Sepharose CL 4B,单克隆抗体特性,理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备,单克隆抗体在医学中的应用,检验医学诊断试剂,（1）病原微生物抗原抗体的检测,（2）肿瘤抗原的检测,（3）免疫细胞及其亚群的检测,（4）激素测定,（5）细胞因子的测定,蛋白质的提纯,肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术,基因工程抗体与抗体库技术,单抗体内应用和疗效受限原因：,1.,鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性,2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少,3.生产成本高,难于普及应用,人杂交瘤技术未获真正突破原因:,融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫,基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。,抗体库技术：用细菌克隆取代,B,细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体,。,单,克隆抗体,药,物概况,单,克隆抗体,（,MAB,）是近年来复合年增,长,率最大的一蛋白,类,药,物，,2001,年全球,销,售,额,增,长,了,57.3%,，接近,30,亿,美元。在,这,类,产,品中开,发,主要集中在癌症治,疗药,物方面。,预计,到,2010,年用于癌症治,疗,的,单,克隆抗体将占其,销,售,总额,的,54.7%,。据,预测,，,单,克隆抗体将会以复合年增,长,率,16.3%,的速度增,长,，到,2010,年达到,121.39,亿,美元的市,场规,模。其中，治,疗,癌症的,单,克隆抗体市,场规,模将达,66.36,亿,美元。,抗体的人源化技术进展,:,单克隆抗体在世界生物工程制药业的支柱产品之一。,单抗将发展成为一大类独立医药产品。,鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代,:,原因：,1.,鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，,2.CDC,作用相应较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱；,3.,与,NK,等免疫细胞表面,Fc,受体亲和力弱，介导的,ADCC,作用较弱；,4.,鼠源抗体半衰期短，发挥,ADCC,与,CDC,作用的时间较短；,5.,鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应。,鼠抗体人源化的构建方法,:,嵌合抗体：,利用,DNA,重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度达到,70%,左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗体仍然保留了,30%,的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应,HAMA,。,表面重塑抗体：,对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体,SAR,差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换,:,互补决定区（,CDR,）构象的残基尽量不替换。,重构抗体,：,由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的，包括,CDR,区移植，部分,CDR,移植和特定决定区（,SDR,）转移。,全人源化抗体,完全人抗体的形成始于二十世纪九十年代，目前获得全人源化抗体方法有抗体库筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。,2.1,抗体库筛选技术,:,抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。,噬菌体抗体库技术：,从免疫或未被免疫的,B,细胞中分离抗体可变区基因；,PCR,扩增抗体全套基因片段,(,如,VH,、,VL),，将体外扩增的,VH,、,VL,基因片段随机克隆入相应载体，形成组合文库；将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因,(g3),或基因,(g8),的先导系列的紧靠下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白,gp,或,gp,的,N,端。用固相化抗原经,“,亲和结合,洗脱,扩增,”,数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。,基因工程小鼠制备全人抗体,全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞,-,严重联合免疫缺陷小鼠（,hu-PBL-SCID,小鼠）、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。,Hu-PBL-SCID,小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠,(SCID),，经抗原免疫后可获得人源抗体。,转基因小鼠：,将人抗体生产基因转入小鼠，以替换小鼠的抗体生成基因。转基因小鼠制备人抗体的优点是，其功效优于其它生产抗人体蛋白单抗技术。不足之处：,(1),转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列，导致不十分完全的人序列；,(2),由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化模式，所以这些单抗最终并不是全人的；,(3),转基因小鼠表达的人,Ig,多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生,IgG,各亚类。,转染色体小鼠：,通过,微细胞介导法（,MMCT,方法）将人,14,号染色体上产生,IgH,的胚系片段和,2,号染色体上,5,50 Mb,的,轻链片段转染到,ES,细胞，获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后，可产生抗人血清白蛋白的人,Ig,，再次免疫后,IgM,产生。由转染色体技术得到的小鼠，表达的人,IgG,各亚类的量与人血清中表达的,IgG,各亚类类同，且可同时在一个转基因小鼠内表达；但是，转染色体小鼠导入的人,Ig,片断虽然比较大，但其表达的人,Ig,量却比较低。,转染色体牛,:,产生人,Ig,转染色体牛的构建过程仍旧利用,MMCT,法，将构建的含有人,Ig,轻重链基因片段的人人工染色体,(HAC),，导入牛胚胎成纤维细胞，进一步发育成转染色体牛。,产生人,Ig,转染色体牛的构建特点在于：,(1),由于牛胚胎干细胞不能成功建系，,因此将人人工染色体导入牛胚胎成纤维细胞；,(2),转染色体牛用核移植的方法来建立；,(3),由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活,35,代，含有人,HAC,的微细胞与牛胚胎成纤维细胞融合后，牛胎儿成纤维细胞只能再存活,7d,，因此必须经过,2,次筛选，确保,HAC,在转染色体牛体内的高存留率。转染色体牛生产人多抗，可以在短时间内大量获得，所以，转染色体牛获得的人多抗可以在一定程度上弥补转染色体小鼠的不足，应付突发事件的发生。,Thanks,for attention,Thanks,Dec.5.2007,摄于新疆喀纳斯湖,2005.8.18,谢谢！,