实验1-大肠杆菌的培养与分离.ppt

单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验1 大肠杆菌的培养与分离,第一部分,:,微生物的应用,实验目的,:,1.,进行,大肠杆菌的扩增,，利用,液体培养基,进行细菌培养的操作,2.,进行,大肠杆菌的分离,用,固体平板培养基进行细菌的划线培养,3.,说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理,特点：,结构都相当,简单,个体多数十分,微小,.,通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构,.,微生物包括哪五类,：,病毒,细菌,放线菌,真菌,原生动物,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,一、基础知识：,(,一,),微生物,：是一切肉眼看不见或,看不清楚的微小生物的总称,(,二,),细菌的常识,1,、结构,2,、分裂,3,、生殖,4,、变异类型,5,、在基因工程中的应用,大肠杆菌,细菌的外形与大小,大肠杆菌属于杆状菌,图,1-1,常见的三种细菌典型形态,A.,球菌,B,.,杆菌,C.,弧菌,根据细菌所利用的,能源和碳源,的不同将细菌分为两大营养类型。,自养菌,:,异养菌,:,腐生菌,寄生菌 大部分病原菌,细菌的营养类型,光能自养型,:,光合细菌,化能自养型,:,硝化细菌,铁细菌,硫细菌,大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌,细菌的革兰氏染色,革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的,差别在于细胞壁的成分不同,。,大肠杆菌属于革兰氏阴性菌,培养基,培养基（培养液）是,由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养,液。,固体培养基,和,液体培养基、半固体培养基,。,1.,培养基的类型,(,三,),细菌的培养,成分区别：琼脂,2.,不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,3.,不管哪种培养基，一般都含有,水,、,碳源,、和,氮源,、,无机盐,、,生长因子,等,营养物质，另外还需要满足微生物生长对,pH,、,氧气,、,渗透压,的要求,细菌喜荤，霉菌喜素,大肠杆菌配方：酵母提取物,0.25g,蛋白胨,0.5g,Nacl,0.5g,琼脂,1g,水,:50ml,4.,培养基的用途,液体培养基：,扩增细菌,、工业生产,固体培养基：,纯化（分离），,鉴定、保藏菌种,单个或少数细菌在,固体培养基,上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的,子细胞群体,，叫做菌落,。,菌落是,鉴定菌种,的重要依据。,菌落,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,无菌技术,1.,无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,成功地培养微生物的关键。,（）,消毒定义：,2.,消毒与灭菌的概念及两者的区别,（,2,）灭菌的定义：,3.,常用的消毒与灭菌的方法,是指杀灭大部分病原微生物的方法。,是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括,芽胞,、,孢子,）的方法,消毒的方法：,1,、,100,煮沸,5-6min,2,、巴氏消毒法：,70-75,下煮,30min,或,80,下煮,15,min,3,、用,75%,酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒,4,、氯气消毒水源,5,、紫外线消毒,灭菌的方法：,1,、灼烧灭菌,2,、干热灭菌：,160-170,下加热,1-2h,。,3,、高压蒸气灭菌：,100kPa,、,121,下维持,15-30min.,1,、灼烧灭菌,灭菌的方法：,2,、干热灭菌：,160-170,下加热,1-2h,。,3,、高压蒸气灭菌：,100kPa,、,121,下维持,15-30min.,1.,无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。,（,1,）培养细菌用的培养基与培养皿,（,2,）玻棒、试管、烧瓶和吸管,（,3,）实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（,1,）、（,2,）需要灭菌；（,3,）需要消毒。,思考,实验用具,LB,固体培养基,大肠杆菌菌液（,LB,液体培养基）,培养皿,接种环,酒精棉,酒精灯,镊子、火柴、记号笔,配制培养基,包器材,灭菌,菌种扩增,倒平板,接种、划线,培养,观察记录,实验流程,二、大肠杆菌的培养和分离实验操作,（一）培养基的配置与灭菌,取,2,个,250ml,的三角瓶中分别装入,50mlLB,液体培养基和,50mlLB,固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌,15min,。,LB,液体培养基,细菌的扩大培养,LB,固体培养基,细菌的划线分离,封口膜：既通气又不使菌进入,（二）倒平板,灭菌后的培养基在,无菌操作台,上倒入,4,个培养皿中，倒后立即置于,水平,位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面,注意事项：,1.,培养基灭菌后，需要冷却到,60,左右时，才能用来倒平板,2.,灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒,3.,操作时右手无名指和小指,夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在,酒精灯火焰旁,操作,.,4.,需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，,灼烧灭菌,5.,平板冷凝后，要将,平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,.,（三）大肠杆菌的扩大培养,将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到,灭菌后的液体培养基,中,使其在,37,摇床培养,12,小时。,注意事项,:,1.,火焰旁,从斜面上用接种环取菌,;,2.,取菌前,接种环要,用酒精灯,灼烧,灭菌,冷却后方能取菌,;,3.,取菌后封口膜和棉塞复原,.,菌种扩增,摇床震荡培养,12h,（于,LB,液体培养基中）,本图来自十一学校,（,四,）大肠杆菌的划线分离,分离方法,:,划线分离法和涂布分离法,1,、划线分离法,无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线,.,平板划线的操作,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；,二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,（,四,）大肠杆菌的划线分离,注意事项,:,1.,接种环,只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置,连续划线多次,.,2.,划线,首尾不能相接,3.,划线后,培养皿,倒置培养,1224h,1,、划线分离法,问题讨论,1.,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了,避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；,每次划线前灼烧接种环是为了,杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种,，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,划线结束后灼烧接种环，能及时,杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.,在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是,消除污染杂菌的通用方法,也是用于,筛选高表达量菌株,的最简便方法之一,2,、涂布分离法,:,是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上,.,划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？,划线分离：,方法简单，但单菌落较难分开。,涂布分离：,单菌落更易分开，但操作复杂。,（,五,）大肠杆菌分离后保存,1,、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于,4,冰箱保存。,2,、长期保存：甘油冷冻管藏法,1.,如何操作才可以尽量避免被杂菌污染,?,(1),胆大心细，操作快捷。（,2,）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（,3,）注意微生物生长条件，如,PH,、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜,37,度；霉菌喜酸，喜糖，喜,25-30,度,2.,在培养后如何判断是否有杂菌污染,?,（,1,）,菌落的形态,看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别,细菌、酵母、放线菌和霉菌,关键指标。,（,2,）,显微镜观察其形态、大小,、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。,（,3,）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用,革兰氏染色法,等。,3.,进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置,?,恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。,4.,实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理,?,所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃,5.,如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌所污染,?,转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的,DNA,序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。,【,课堂练习,】,例,1,关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）,A.,是碳源的物质不可能同时是氮源,B.,凡碳源都提供能量,C.,除水以外的无机物只提供无机盐,D.,无机氮源也能提供能量,D,例,2,下面对发酵工程中灭菌的理解,不正确,的是（）,A.,防止杂菌污染,B.,接种前菌种要进行灭菌,C.,培养基和发酵设备都必须灭菌,D.,灭菌必须在接种前,B,编号,成分,含量,粉状硫,10g,（,NH,4,）,2,SO,4,0.4g,K,2,HPO,4,4.0g,MgSO,4,9.25g,FeSO,4,0.5g,CaCl,2,0.5g,H,2,O,100ml,例,3,右表是某微生物培养基成分，请据此回答：,（,1,）右表培养基可培养的微生物类型是,。,（,2,）若不慎将过量,NaCl,加入培养基中。,如不想浪费此培养基，可再加入,.,自养型微生物,含碳有机物,（,3,）若除去成分，加入（,CH2O,），该培养基可用于培养,。,（,4,）表中营养成分共有,类。,（,5,）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是,。,（,6,）右表中各成分重量确定的原则是,。,（,7,）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分,。,固氮微生物,3,调整,pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,