酶的活性.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学,第二章 核酸的化学,核酸的性质与,研究方法,4,核酸的理化性质,5,核酸的分离纯化、测定,及研究方法,第二章 核酸的化学,核酸的性质是由其结构决定的。,核酸的结构特点,是分子大,有一些可解离的基团,具有共轭双键等,.,这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性质的基础,.,下面介绍几种重要的性质,:,2.6,核酸的理化性质,一、物理性质,1、,性状,：,RNA,及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色粉末或结晶；,DNA,则为疏松石棉一样的纤维状固体。,2、,粘性,：,核酸的水溶液粘度很大，,粘度,DNA,大于,RNA。,核酸变性后，粘度下降。,2.6,核酸的理化性质,3、,溶解性,：,RNA,和,DNA,都是,极性的化合物,，一般说来，这些化合物都,微溶于水,，,不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂,。它们的,钠盐,易溶于水。,DNA,和,RNA,在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。,DNA,核蛋白与,RNA,核蛋白的溶解度受溶液的,盐浓度,的影响而不同。,DNA,蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加；,而,RNA,蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小.,4,核酸的理化性质,二、核酸的紫外吸收性质：,核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的性质，在260,nm,处核酸紫外吸收最强。核酸紫外吸收是核酸定量测定的基础。,4,核酸的理化性质,1.DNA或RNA的定量,OD,260,=1.0,相当于,50,g/ml双链DNA,40,g/ml单链DNA（或RNA）,20,g/ml寡核苷酸,2.判断核酸样品的纯度,DNA纯品:,OD,260,/OD,280,=1.8,RNA纯品:,OD,260,/OD,280,=2.0,OD,260,的应用,三、核酸结构的稳定性,核酸的结构相当稳定,其主要原因有,:,1,、碱基对间的氢键,在,DNA,双螺旋和,RNA,的双螺旋区，碱基对的大小使其在螺旋内的距离很适合于形成氢键,、碱基堆积,碱基堆积力对维持核酸的空间结构起主要作用,、环境中的正离子,4,核酸的理化性质,四、核酸的两性电离与等电点,核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有,两性电离的性质,。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。,DNA,的,pI,约为45，,RNA,的,pI,约为2.02.5，,在,pH78,电泳时泳向正极。,4,核酸的理化性质,五、,DNA,的变性、复性与分子杂交,DNA,双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释,DNA,的重要特性变性与复性，这对于深入了解,DNA,分子结构与功能的关系又有重要意义。,（一）,DNA,变性(,denaturation,),1、,DNA,变性的概念,：指,DNA,分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。,4,核酸的理化性质,2、,DNA,变性的本质,：维持双螺旋稳定性的,氢键断裂,，,碱基间的堆积力,遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。,3、,导致,DNA,变性的因素,：,凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的,pH、,有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,4、,变性,DNA,的特征：,（1）溶液粘度降低：,DNA,双螺旋是紧密的刚性结构，变性后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构，因此粘度明显下降。,（2）旋光性发生变化：变性后整个,DNA,分子的对称性及分子构型改变，使,DNA,溶液的旋光性发生变化。,4,核酸的理化性质,（3）紫外吸收增强,增色效应,(,hyperchromic,effect)：,指,DNA,变性后其紫外吸收明显增强的效应。,DNA,分子中碱基间电子的相互作用使,DNA,分子具有吸收260,nm,波长紫外光的特性。在,DNA,双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时,DNA,双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。,4,核酸的理化性质,可见，,DNA,变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称,融解温度,(,Tm,melting temperature)。,在,Tm,时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的,Tm,值与其,GC,所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为：,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,Tm=69.30.41(G+C)%,一定条件下(相对较短的核酸分子)，,Tm,值大小还与,核酸分子的长度,有关，核酸分子越长，,Tm,值越大；另外，,溶液的离子强度,较低时，,Tm,值较低，融点范围也较宽，反之亦然，因此,DNA,制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,(二),DNA,的热变性与复性(,renaturation,),指经加热变性的,DNA,在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性,DNA,一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为,退火,(,annealing)。,这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,DNA,的复性不仅受温度影响，还受,DNA,自身特性等其它因素的影响：,1、温度和时间：,一般认为比,Tm,低25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过,Tm,的温度下迅速冷却至低温(如4以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持,DNA,的变性(单链)状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。,4,核酸的理化性质,2、,DNA,浓度：,溶液中,DNA,分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于复性。,3、,DNA,顺序的复杂性：,简单顺序的,DNA,分子，如多聚(,A),和多聚(,U),这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得多。,4,核酸的理化性质,DNA,的变性和复性原理，现已在,医学,和,生命科学,上得到广泛的应用。如核酸杂交与探针技术，聚合酶链反应(,polymerase chain reaction,PCR),技术等。,4,核酸的理化性质,（三）分子杂交：(,hybridization),不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的,杂化双链,(,heterodup,lex,)，,这个过程称为,杂交,(,hybridization)。,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,杂交可以发生于,DNA,与,DNA,之间，也可以发生于,RNA,与,RNA,之间和,DNA,与,RNA,之间。,例如，一段天然的,DNA,和这段,DNA,的缺失突变体(假定这种突变是,DNA,分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓起小泡。测定小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多少。,4,核酸的理化性质,核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来检验核酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中的关系，其主要应用如下图所示：,4,核酸的理化性质,核酸杂交及其应用示意图,.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同,DNA。,A,是杂化双链,B,代表天然,DNA；,C,是,B,的缺失突变体；虚线框内是,已缺失的部分；,D,是显示从天然,DNA,链鼓,.突变体的鉴别。,.粗线代表探针，粗线上的,X,表示放射性标记,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,4,核酸的理化性质,在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称,探针技术,(,Probe)。,探针技术在,遗传性疾病诊断,上已开始应用。,例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取,DNA，,这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状,4,核酸的理化性质,的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量,DNA,后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。,杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛的应用。,4,核酸的理化性质,一、分离核酸的一般原则,因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故,完整的一级结构,是保证核酸结构与功能研究的基础。,保证核酸一级结构的完整性；,排除其它分子的污染。,（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：,4,核酸的分离纯化、测定及研究方法,（二）核酸的纯度要求,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；,其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；,排除其它核酸分子的污染，如提取,DNA,分子时，应去除,RNA，,反之亦然。,5,核酸的分离纯化,（三）核酸分离纯化的注意事项,为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：,尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；,减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在,pH410,条件下进行；,5,核酸的分离纯化,防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中,DNA,酶需要金属二价阳离子,Mg,2+,，Ca,2+,的激活，因此使用金属离子螯合剂，如,EDTA,或柠檬酸盐等基本上可以抑制,DNA,酶的活性。而,RNA,酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是,RNA,提取过程中的主要危害因素；,5,核酸的分离纯化,减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。,机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及,DNA,样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性,DNA,分子，如真核细胞的染色体,DNA,等。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为04以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。,5,核酸的分离纯化,二、核酸分离纯化的一般步骤,破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥溶解,核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。,5,核酸的分离纯化,三、核酸的测定方法,1、紫外吸收法,在一定,pH,下测定样品的紫外吸光度（,A,260,），,即可由下式计算样品中的核酸含量：,C=M,rA,260,/,L,其中：,C,为核酸的含量（,mg/,mL），Mr,为相对分子质量，,A,260,为核酸溶液的吸光度，,为摩尔消光系数（即1升溶液中含1摩尔核酸的光吸收值），,L,为比色杯的内径（,cm）,5,核酸的分离纯化、测定及研究方法,5,核酸的分离纯化、测定及研究方法,2、定糖法,RNA,的测定：,RNA,分子中所含的核糖经浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，糠醛可与3，5-二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚）反应生成,绿色,化合物,，该化合物可在670-680,nm,波长下进行比色测定。,DNA,的测定：,DNA,分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成,兰色化合物,，该化合物可在595-620,nm,波长下进行比色测定。,5,核酸的分离纯化、测定及研究方法,3、定磷法,RNA,和,DNA,中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，测出核酸中的磷含量就可计算核酸的含量。测定时先将核酸用强酸消化成无机磷酸，后者与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，在经过还原作用而生成,蓝色的复合物,，最后在650-660,nm,进行比色测定。,5,核酸的分离纯化、测定及研究方法,四核酸研究方法,（一）核酸的沉降特性,溶液中的核酸在引力场中可以下沉。在超速离心机造成的强大的离心力场中，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的超速离心用于：,1、测定核酸的浮力密度；,2、测定,DNA,分子中的,G、C,含量；,5,核酸的分离纯化、测定及研究方法,3、测定溶液中核酸的构象，核酸经染料氯化铯密度梯度离心以后，在离心管里，沉降的速度由大到小依次为：,超螺旋,DNA、,闭环质粒,DNA、,开环及线型,DNA，,若,样品中含有蛋白质，蛋白质沉降速度最小。,4、核酸的制备。,5,核酸的分离纯化、测定及研究方法,5,核酸的分离纯化、测定及研究方法,（二）核酸的凝胶电泳,凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法，有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者常用于,DNA,的分离分析，后者用于,RNA,的分离分析。,5,核酸的分离纯化、测定及研究方法,5,核酸的分离纯化、测定及研究方法,1:,DL2000,2,:,PCR,扩增产物 3,:,重组质粒,PCR,鉴定 4,:,重组质粒,酶切鉴定 5,:,重组质粒,1 2 3 4 5,1 2 3 4 5,1:,引物,p4,与,p5 PCR,结果,2:,引物,p3,与,p5 PCR,结果,3:,引物,p2,与,p5 PCR,结果,4:,引物,p1,与,p5 PCR,结果,5:DL2000,50,2,bp,2000,bp,2000,bp,50,2,bp,核酸的凝胶电泳,测 序,PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法，主要有三个步骤,：,1、变性：,目的双链DNA片段在94下解链；,2、退火：,两种寡核苷酸引物在适当温度（50左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；,3、延伸：,在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下以目的DNA为模板进行合成。由这三个步骤构成一个循环，理论上每次循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经2535轮循环可使DNA扩增达10,6,倍。,如果人体有10,14,个细胞，每,个,细胞DNA含量6.410,9,bp，试计算一下人体DNA的总长度为多少米？它相当于地球到太阳的距离（2.210,9,km）之几倍？,例题1,：,大肠杆菌噬菌体T2 DNA的相对分子质量为12010,6,，它的头部长约210nm,假定每个核苷酸对的相对分子质量为650，计算T2 DNA的长度和头部长度的比？,例题2：,一双链DNA的一条链中的A,0.3，G,0.24，问：,1）该条链中的T和C时多少？,2）该条链的互补链中，T、C、A和G应时多少？,例题3：,噬菌体M13 DNA它的碱基组成是：,A，23%，T，36%，G，21%，C，20%，,这个碱基组成说明M13 DNA具有什么特点？,例题4：,