食品中营养成分综合测定技术.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,食 品,营养成分综合测定技术,第一节,水分和水分活度的测定,一、水分的测定,（一）测定意义及方法,1,、意义,（,1,）保持食品良好性状,(,感观,),如新鲜面包 水分,32-42%16%,固态样品 可采用,浓稠态样品，加入精制海砂 或无水硫酸钠，使其增大蒸发面积，防止结硬壳焦化，内部水蒸发受阻。,液态样品：为防止沸腾造成损失，先低温浓缩,-,再干燥,(,热水浴,),或 用比重法，折光法测固形物。,水分,%=100%-,固形物,%,2,、减压干燥法,使用范围：易发生热分解,变质,不易除去结合水的食品,(,糖浆,果糖,味精,麦乳糖,果蔬制品,),原理,:,低压下,沸点下降,即低温下干燥,.,测定方法,:,减压干燥,果酱 脱水蔬菜 糖制品,P mmHg 100,100 50,温度,70 70 70,h 2 6 2,3,、红外线干燥法,特点及适用范围,快速（,10-30min,）,精密度差,一定允许范围，偏差,原理：红外灯管为热源,利用辐射热及直射热加热试样,快速蒸去水分,并同时称重。,4,、蒸馏法,原理：二互不相溶的液体沸点低于各组分的沸点,将食品中的水分与有机溶剂甲苯、二甲苯等沸蒸出、冷凝、收集、分层，即可测水分含量。,有机溶剂的物理常数表,特点及适用范围：,高效换热,水分迅速移去。密封,加热温度低，设备简单,操作方便。,适用于因加热易氧化,分解,含有大量挥发性组分的样品。,特别适用于香料、油类水分的测定,测定方法：,试剂制备：新蒸馏甲苯或二甲苯,(,以水饱和,蒸馏,收集液备用,),样品,-,烧瓶,以,50-75ml,甲苯浸没样品,从冷凝管上口蒸馏至水分量不再增加,(,水被集中在计量管下部,溢出的甲苯又被蒸馏,),读水的容量,计算,H,2,O%=V/W*100 (Vml,，,Wg),5,、,卡尔,.,费休法 （,Karl.Fischer,）,11,（,1,）原理,根据下列反应能定量进行,SO,2,+I,2,+2H,2,O=H,2,SO,4,+2HI,为使反应顺利进行,需加入吡啶（,C,5,H,5,N,）,中和,H,2,SO,4,，甲醇（,CH,3,OH,）,防止硫酸吡啶于,H,2,O,发生副反应,总反应,:,（,I,2,+,SO,2,+3,C,5,H,5,N+CH,3,OH)+H,2,O,2 C,5,H,5,NHI+C,5,H,5,NHSO,4,CH,3,终点滴定方法,:,1%,过量,I,2,棕黄色；电极安培滴定法,适用于深色样品，微量水分测定,（,2,）适用范围,是测定痕量水分的理想方法,可测,1ppm H,2,O,适用范围广,固、液、气,1ppm-100%H,2,O,（,3,）测定,卡尔,.,费休试剂的制备及标定,a,配比：,85g,I,2,670ml,CH,3,OH,270ml C,5,H,5,N,60-70gSO,2;,暗处,24h,b,标定：,向水分测定仪的反应器中加入,50ml CH,3,OH,用卡尔费休试剂滴入,使其作用无水,CH,3,OH,中痕量水分,使其微安表指向一定刻度值,（,45,或,48,A,）,用微量注射器注入,10g,水,滴入卡尔费休试剂,记录用量,卡尔费休试剂对,H,2,O,的滴定度,T(mg/ml),T=G1000/V,（,G-,水重，,V-,卡尔,.,费休试剂,ml,）,测定,:,称样,0.3-0.5g(H,2,O 20-40 mg)(,代替,10g H,2,O,标定中,),加入反应器中,以下同标定,(CH,3,OH,作萃取剂,),计算,H,2,O%=,（,TV100,）,/,（,w1000,）（,w-,样重）,说明,:,快速,准确,含维生素,C,等还原性组分的样品不适宜用此法,.,测得水分为总水分,=,自由水,+,结合水,二、水分活度的测定,1,、测定意义及测定方法,测定方法有：蒸汽压力法、电湿度计法、附敏感器的湿动仪法、水分活度测定仪法、扩散法、溶剂萃取法，常用的为后三种。,2,、,A,W,测定仪法,（,1,）原理：一定温度下,A,W,测定仪中的传感器,对蒸汽压力的变化,指针偏转,恒定时,读取,A,W,读数。,（,2,）测定：仪器校正，在饱和,BaCl,2,溶液中浸入两张滤纸,浸湿后,放入样品盒内,传感感器表头放在盒上,置于,20,恒温箱中,恒温,3h,。拧动,使指针指向,0.900,，重复。样品测定，取样,经,20,恒温后,置于样品盒内,均匀放平（,2cm,厚）不高出垫圈底部,将传感器表头置于样品盒上,拧紧,放,2h,待指针不变时,读出,Aw,值,（,3,）说明：经常用饱和,BaCl,2,溶液校正仪器，表头勿沾上样品，,Aw,的温度校正,3,、扩散法,（,1,）原理：样品在康威氏微量扩散器的密封和恒温条件下,分别在,Aw,较高和较低的标准饱和溶液中扩散平衡后,根据样品的增减量求,Aw,。（标准试剂,Aw,值见,P48,表,4-2,）,（,2,）测定方法：准确称取样品,1.000g,装入铝皿或玻璃皿中,迅速放入康威氏扩散皿内室中,室外放入标准饱和溶液,5ml,边缘涂凡士林,加盖密封,在,250.5,放置,20.5h,（平行作,2-4,份不同,Aw,值的标准饱和溶液及样品）,取出,迅速称重,计算各样品每克质量的增减数。,以,Aw,标准为横坐标,mg,样品量为纵坐标,在方格坐标纸上作图,交点处为样品,Aw,示例,:,某食品样品在硝酸钾,(,0.924),中增重,7mg,，在溴化钾,(,0.807),中减重,15 mg,，可求得其,Aw=0.878,0.924 0.878 0.807,4,、溶剂萃取法,（,1,）原理：用苯萃取样品中的水分,其萃取出水量与样品中水分活度成正比,用卡尔费休法测定食品和纯水中萃取的水量,其比之即为,Aw,（,2,）测定：卡尔费休试剂制备,（代替吡啶）,CH,3,OH CH,3,COONa KI I,2,SO,2,甲液,100ml 8.5g 5.5g 3-10g,乙液,500ml 42.25g 27.8g 37.65g,甲乙二液混合于棕色瓶中,并套薄膜,置于冰浴中,静置一昼夜,干燥器中准确称取试样,1.0000g,与磨口三角瓶中加入苯,100ml,盖塞,振摇,1h.,静置,10min,加入,100ml,无水乙醇混合,取,50ml,用卡尔费休试剂滴至微橙红,记录,Vn ml,数,;,同样用,1.0000ml,重蒸馏水,代替样品作试样,记录,V,0,（,3,）计算,:Aw=Vn/V,0,作业：,1,、一般食品中的水分含量如何测定？（写出具体的测定步骤）,2,、痕量水分的食品中的水分含量用什么方法测定？（只写出测定方法的名称）,3,、扩散法测定食品中的水分活度如何测定？（写出具体的测定步骤）,第二节 酸度的测定,一、概念及分类,有不同概念的酸度：有总酸度、有效酸度、挥发酸、牛乳酸度,1,、总酸度,总酸度,食品中所有酸性成分的总量。又可称为滴定酸度。包括已离解的和未离解的酸的浓度,2,、有效酸度,有效酸度,被测溶液中,H,+,的浓度（准确说是,H,+,的活度）。即已离解的酸的浓度，用酸度计（,pH,计）测定,3,、挥发酸,挥发酸,易挥发的有机酸（甲、乙、丁酸等）,4,、牛乳酸度,固有酸度（外表酸度）,新鲜牛乳的酸度（酪、白蛋白；柠檬酸、磷酸盐），一般占,0.15,0.18,（以乳酸计）,发酵酸度（真实酸度）,牛乳放置后，酸度升高的那部分酸度（乳糖发酵乳酸）,发酵酸度,=,总酸度固有酸度,含酸量,0.2,为不新鲜牛乳,二、测定意义,1,、有机酸与食物的色、香、味及稳定性有关,色：叶绿素、花青素与酸度有关,香：挥发酸给予食品特定香气,味：甜酸比适当,各自独特味道,稳定性：,pH,低抑制细菌生长，防止,Vc,氧化,2,、判断质量好坏的重要指标,挥发酸种类及含量可判断腐败程度,发酵制品：甲酸细菌性腐败,水果发酵品：,0.1,醋酸（挥发酸）腐败,牛乳（啤酒）乳酸,0.2,腐败,油脂（酸价）游离脂肪酸腐败,3,、判断果蔬成熟程度,确定加工工艺条件；果蔬 酸度甜度则成熟度,加工工艺与酸度有关,三、总酸度的测定,1,、直接滴定法,a,样液制备,固,碎,液,定容,过滤,取液,（含酸,0.035,0.07g,）使耗,0.1mol/L NaOH,5ml,，一般最好,10,25mL,（除,CO,2,）,b,滴定,取制备液,50ml,，酚酞,3,4d,，以,0.05mol/L,或者,0.1mol/L NaOH,滴定,2,、电位滴定法,(,适用于颜色深的样品）,以电位突变确定终点，,pH=(E,0,-E)/0.059,总酸度（）,=(VCK,100,)/m,（,V/V,o,）,K,主要酸换算系数,3,、说明,各类食品的酸度常以主要酸表示,K,为中和,1mmol NaOH,相当于酸的克数,葡萄及制品 酒石酸,K=0.075,柑橘及制品 柠檬酸,K=0.064,苹果 苹果酸,K=0.067,乳、肉 乳酸,K=0.090,酒类、调味品,HAc K=0.060,乳品、面包等食品以,T,表示,即中和,100g,（,ml,）样品所需,0.1mol/L NaOH,的毫升数,一般 新鲜牛乳,16,18,T;,面包,3,9,T,标准：婴儿配方乳粉,（,GB10766-89,）,优级 一级 合格,乳酸度,14,T,15,T,16,T,四、有效酸度的测定,1,、电位法,（,1,）样品处理,液态样品：除,CO,2,后测定,固态样品：捣碎，,10g,样品,/100ml,水，过滤后测定,(1,10),含油量较高的样品：先分离油后再测定,（,2,）测定,预热、调零,校正（以接近的标准缓冲溶液校正）,测定,2,、比色法,（,1,）试纸法：快，不准确,（,2,）标准管比色法：要求色度低,0.1pH,标准酸色管系列（加指示剂），不准确,五、挥发酸的测定,正常食品挥发酸含量较稳定，糖的发酵可使挥发酸含量增加，降低品质，所以是质量控制指标。,1,、直接法,直接法是通过水蒸气蒸馏或溶剂萃取把挥发酸分离出来，再用标准碱溶液滴定（用于挥发酸含量高的样品）,例：水蒸气蒸馏法,a,原理,样品处理后，加入适量（,1.00mL10,）,H,3,PO,4,，使结合态挥发酸游离出来，用水蒸气蒸馏出总挥发酸，冷凝收集液滴定，下同总酸度测定，作空白试验,B.,滴定,:,流出液加热至,60,65,，加入酚酞三滴，用,0.1MNaOH,滴定至微红色。,C.,计算,:,醋酸,=(V,1,-V,2,)C,0.06100,/m,0.06,换算系数，即,0.06g,醋酸,/1mmoLNaOH,D.,说明,:,若含,CO,2,及,SO,2,应排除干扰,CO,2,在电磁搅拌下，低真空抽气,SO,2,用,I,2,滴定（淀粉指示剂）,扣除滴定量,2,、间接法,用碱滴定不挥发酸（用于挥发酸含量少或蒸馏液有损失或被污染的样品）,挥发酸,=,总酸不挥发酸,挥发酸的测定还可用色谱法测定,作业：,1,、写出有总酸度、有效酸度、牛乳发酵酸度的概念。,2,、中和牛乳样品,50.00ml,用去,0.085mol/L NaOH 10.00ml,，该牛乳的酸度为多少,T,？,3,、分析柑橘类果实及其制品时，用（）酸表示，,K=0.064,K,是换算为主要酸的系数，即指（）。,第三节 脂类的测定,一、概述,1,、脂类 脂肪（不同的三酰甘油酯）,类脂（磷脂、糖脂、甾醇、固醇、,V,脂,）,2,、重要营养成分之一,（热能、必需脂肪酸、,V,脂载体、调节生理）,3,、影响食品的品质、质构及风味,4,、测定意义：评价品质、营养价值、质量管理、贮藏方式,5,、提取剂的选择 常用溶剂：,乙醚（溶解强、沸点低、易燃、可含,2,H,2,O,易抽出糖分,石油醚（溶解弱于乙醚、含,H,2,O,少）,以上两种均不能提取结合态脂,氯仿,甲醇（可提取脂蛋白、磷脂，适合于水产品、家禽、蛋制品）,6,、预处理,碎、烘干、加海砂（防结块）、无水,Na,2,SO,4,（,H,2,O,高时）（减小水量）,7,、脂类的常用测定方法,食品的种类不同、脂肪含量及存在形式不同，测定方法也就不同。,（,1,）索氏提取法,（,2,）氯仿,甲醇提取法,（,3,）酸水解法,（,4,）罗紫,哥特里法,（,5,）巴布科克法,（,6,）盖勃法,二、索氏抽提法,1,、原理,干燥样品用无水乙醚或石油醚回流提取，游离脂肪、磷脂、糖脂；色素、蜡、树脂等粗脂肪进入溶剂中，再回收溶剂，即得残留物,粗脂肪,2,、适用范围,脂肪含量较高，结合态脂肪少，能烘干、磨细、不易吸湿结块的样品。（结合态脂肪测不出来）,3,、测定,（）将索氏抽提器各部件洗净，,烘干，其中抽提瓶烘到恒重。,（）用烘盒称取样品,2-5g,。,（）将试样转入滤纸筒内。,（）将抽提器安装妥当，然后将装有试样的滤纸筒置于抽提管内，同时注入溶剂至虹吸管高度以上，待其流净后，再加至虹吸管高度三分之一处，用一小块脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口，打开冷凝管水管，开始加热抽提。加热温度控制在每分钟回流的溶剂为,120-150,滴，每小时回流,7,次以上，抽提的时间须视试样及含油率高低而定，一般约,4-8,小时及以上，抽提至抽提管内的乙醚用玻璃片检查（点滴试验）无油迹为止。,（）抽净脂肪后，用长柄摄子取出滤纸筒，再加热使乙醚回流,2,次，洗下可能留在抽提管上的粗脂肪后回收乙醚。,（）溶剂回收完毕，取下冷凝管和抽提管，用脱脂棉蘸溶剂揩净抽提瓶外部后，置抽提瓶在,105,下先烘,90,分钟，冷却称重，再烘,20,分钟，烘至恒重为止（前后二次重量差不大于,0.0002g,以内即为恒重）。抽提瓶增加的重量即为所得粗脂肪的重量。,4,、计算,X=(m,1,-m,0,)/w 100%,三、酸水解法,（酸性乙醚提取法）,1,、原理,试样,+HCl,（水解）游离脂乙醚（石油醚）提取称重（游离脂肪,+,结合脂肪总量,2,、适合范围及特点,适用于不能用索氏抽提法的易吸湿结块、不易烘干、加工后混合食品（含结合脂）。,但不适用于含磷脂较多的鱼、贝、蛋及含食糖高的食品。,磷脂脂肪酸,+,碱，分解损失；,糖,+HCl,碳化 影响结果,3,、测定方法,试样,+HCl(75,水浴，,45min),消化,多次提取,消化试样,+10ml,乙醇具塞量筒中（,+,乙醚）摇、静置取上清液（,+,乙醚、石油醚）洗（,+,乙醚）摇、静置再提取上清液已称重的锥形瓶内,蒸干、烘干,（回收溶剂后，水浴上蒸干，,100,105,下烘干）,称重,4,、计算,m,2,-m,1,脂肪（,%,）,=-100,m,5,、说明：样品充分磨碎，样液混匀，消化至无块状碳粒。,加入乙醇、石油醚作用：乙醇：沉淀蛋白质促进脂肪球聚合,石油醚：降低乙醇在乙醚中溶解度使乙醇溶解物留在水层。,残留物若有黑色焦状杂质，可用乙醚,石油醚溶解、过滤,四、氯仿,甲醇提取法（,CM,法）,1,、适用范围及特点,适用于结合态脂类（如磷脂、蛋白脂）如：鱼、贝、肉、禽、蛋、豆及制品并适用于高,H,2,O,试样测定（干燥样品加,H,2,O,）（索氏法不提结合脂、酸水解法使磷脂分解损失）,2,、原理 （,P66,图,4-5,提取装置）,试样分散于氯仿,甲醇,水（试样中的）三种溶剂中，可提取全部脂类（氯仿层），滤去（甲醇层）非脂部分，回收溶剂，用石油醚提取（包括残留）脂类，去石油醚后，称脂重。,3,、测定方法,5g,样品（,+CM,液,60ml,）具塞三角瓶（,65,水浴）回流,1h,过滤滤液（,70,水浴）蒸发（回收溶剂）,(+25ml,石油醚,+15g,无水,Na,2,SO,4,）,离心 取醚层,10ml,除醚称重,4,、计算,m,1,-m,0,脂肪（,%,）,=-100,m10/25,5,、说明溶剂回收时，不能蒸发至完全干涸（否则石油醚难溶解脂肪）从加入到吸收石油醚中，应避免其挥发（保证体积准确）,五、罗紫,哥特里法,（,Rose-Gottlieb,）（碱性乙醚提取法）,1,、适用范围,液状乳、乳制品,GB/T5009.46-1996,2,、原理（重量法）,利用氨,乙醇溶液破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂肪成分溶解于氨,乙醇溶液中，脂肪游离出来。再用乙醚,石油醚提取脂肪，去溶剂称重乳脂肪。,3,、测定,10ml,或,1g,样品,(+1.25ml,氨水）提脂瓶（,65,水浴,5min,）振摇,(+10ml,乙醇）振摇 冷却（,+25ml,乙醚）摇（,+25ml,石油醚）摇 静置,30min ,读,V,醚（总体积）放,V,1,醚层（部分）烧瓶,m,1,去醚烘干称重,m,2,4,、计算,m,2,-m,1,脂肪（,%,）,=-100,mV,1,/V,5,、说明,因为脂肪球被酪蛋白钙盐包裹，所以需用氨水处理成为可溶性盐。,乙醇使蛋白质沉淀，防止乳化，溶解醇性物质进入水层。,石油醚可使提出液中水分减少，在乙醇及石油醚作用下，使可溶性非脂成分（如糖分等）减少，分层清晰。,可用,100ml,具塞量筒代替抽脂瓶，用移液管吸取醚层。,六、巴布科克法和盖勃法,Babcock,、,Gerber GB/T5009.46-1996,1,、适用范围及特点,糖少（不加糖）的鲜乳及乳制品（糖多的易焦化，误差大）,此法简便、迅速、不如重量法准确但能满足精度要求（标准方法）,2,、原理（容量法）,（湿法提取）浓,H,2,SO,4,乳（溶解糖、蛋白质、结合脂肪破坏）游离脂肪离心读取脂肪层数值,3,、巴布科克法（,P67,图,4-6,）,17.6ml,鲜乳巴氏瓶,17.5mLH,2,SO,4,混合（至无凝块）离心（,1000r/min5min,）（,80,水至颈部）离心,2min,（,80,水至刻度间）离心,1min,静置,5min,读数,脂肪,解释,:,牛乳,=1.03g/ml17.5ml=18g,脂肪,=0.9g/ml0.2ml,（,1,大格）,10,格,=1.8g/10,大格,每大格,1,（,1.8/18,）,10,）,4,、盖勃法,10mlH2SO4+11ml,乳,+1ml,异戊,醇,盖氏乳脂汁 口向下 振摇静置,5min,水浴（,65,705min,）调橡皮塞（脂肪在刻度内）离心水浴（,65,705min,）取出读数（上下差）脂肪,说明如下：,a.,硫酸破坏乳脂肪球膜，增加密度低脂肪易析出、浮出；,b.,异戊醇促使脂肪析出，降低脂肪球表面张力，使形成连续脂肪层。,c.,加热（水浴）离心的目的是促使脂肪离析,d.,刻度数,=,脂肪,三种测定乳脂肪方法的准确度比较：,罗紫,哥特里法巴布科克法盖勃法,七、过氧化值的测定,1,称取混合均匀的油样,2-3g,于碘量瓶中，或先估计过氧化值，再按表称样。,2,加入氯仿,-,冰乙酸混合液,30ml,，充分混合。,3,加入饱和碘化钾溶液,1ml,，加塞后摇匀，在暗处放置,3,分钟。,4,加入,50ml,蒸馏水，充分混合后立即用,0.01mol/L,硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色时，加淀粉指示剂,1ml,，继续滴定至蓝色消失为止。,5,同时做不加油样的空白试验。,油样的过氧化值按下式计算,过氧化值,(I,2,%)=(V,1,-V,2,)N0.1269/W 100,V,1,-,油样用去的硫代硫酸钠溶液体积,ml,V,2,-,空白试验用去的硫代硫酸钠溶液体积,ml,N-,硫代硫酸钠溶液的当量浓度,W-,油样重,g,0.1269-1mg,当量硫代硫酸钠相当于碘的克数,用过氧化物氧的毫克当量数表示时，可按下式计算,过氧化值（,meq/kg,）,=(V,1,V,2,)N/W1000,两种表示法间的换算关系,meq/kg,=,I,2,%,78.9,八、酸价的测定,1,称取均匀的油样注入锥形瓶。,2,加入中性乙醚,-,乙醇溶液,50ml,，摇动，使油样完全溶解。,3,加,2-3,滴酚酞指示剂，用,0.1mol/L,的碱液滴定至出现微红色在,30,秒内不消失，记下消耗的碱液毫升,四、结果计算,以酸价表示油脂酸价按下列公式计算,酸价（,mg KOH/g,油）,=V C56.1/W,用游离脂肪酸的百分含量来表示：,FFA%=AV,脂肪酸分子量,/56.1081/10,对于某一脂肪酸，其分子量为常数，于是,f=,脂肪酸分子量,/56.108 1/10,则,FFA%=f AV,作业题：,1,、对脂肪含量较高，结合态脂肪少，能烘干、磨细、不易吸湿结块的样品，用什么方法测定其脂肪含量？写出具体的测定步骤及结果计算方法。,2,、用什么方法测定含磷脂的结合态脂类的样品中的脂肪含量？用什么方法测定液状乳、乳制品的脂肪含量？（只要求写出测定方法名称）,3,、测定脂肪时常用的提取剂有哪些？各自的特点如何？,第四节 蛋白质和氨基酸的测定,（一）测定方法概述,1,、测定蛋白质含量的方法：,凯氏定氮法,快速测定法（双缩脲、紫外、水杨酸比色、染料结合法）,2,、测定氨基酸的方法：,甲醛、电位滴定、茚三酮比色,气相、液相、薄层、离子交换色谱、,自动分析仪,（二）凯氏定氮法,1,、实验原理,以硫酸铜为催化剂，,用浓硫酸消化试样，,使有机氮分解为氨，,与硫酸生成硫酸铵。,然后加碱蒸馏使氨逸出，,用硼酸溶液吸收，再用,盐酸标准溶液滴定。根,据盐酸标准滴定溶液的,消耗量计算蛋白质的含量。,2,、实验步骤,（,1,）试样的制备与称样（称,0.5-5g,试样（含氮,30-40mg,）放入凯氏烧瓶中）,（,2,）消化,向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜,0.4g,、硫酸钾,10g,、硫酸,20mL,。将凯氏烧瓶放在电炉上，缓慢加热。待起泡停止，内容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热,0.5-1h,。取下凯氏烧瓶冷却至约,40,，缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。,（,3,）蒸馏与吸收,将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到,100mL,容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。,向接收瓶内加入,30mL2%,硼酸溶液和,1,滴混合指示剂。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取,100.05mL,稀释定容后的试液，沿小玻璃杯移入反应室。并用少量水冲洗小玻璃杯，一并移入反应室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约,10mL40%,氢氧化钠溶液。提起玻璃塞，使氢氧化钠溶液缓慢流入反应室。立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸馏,5min,。降低接收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸馏,1min,。用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。,（,4,）滴定,用,0.1mol/L,盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。,同一试样做两次平行实验，同时做空白实验。,3,、结果计算 （,p70-71,）,（,V,0,/V,）,0.014c,X(%)=-,F100,m,(10/100),(,三,),快速测定法,为满足生产过程的快速控制分析，减少环境污染、简便操作省时，建立了快速测定方法,如：双缩脲法、紫外分光光度法、水杨酸比色法、染料结合法,1,、双缩脲法,（,1,）原理：双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜结合生成红紫色络合物。蛋白质中含有肽键，与双缩脲结构相似，也呈此反应。在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比；,max=560nm,可用吸收光度法进行比色测定。,（,2,）测定,标准曲线绘制,以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样，按蛋白质含量,40,、,50,、,60,、,70,、,80,、,90,、,100,、,110mg,称取样品,8,份于钠氏比色管中，各加入,1mlCCl,4,（阻滞淀粉、还原糖、色素、类脂物溶解，消除干扰）加入双缩脲试剂（酒石酸钾钠，,KOH,，,CuSO4,）,50.00ml,振摇均匀（,10min,）静置,1h,，取上层清液离心,5min,，再测,max=560nm,时的,A,（水作参比）,样品测定,准确称取适量样品，同样方法测样品的,A,（,3,）计算,x,蛋白质（）,=-100,w,x,从标准曲线中查得蛋白质含量，,mg,w,测定样液相当样品质量，,mg,（,4,）说明,高脂肪样品，先用醚抽出弃之,若有不溶物可抽出蛋白质后再测,2,、水杨酸比色法,（,1,）原理,:,样品中蛋白质经硫酸消化后转变为铵盐，与水杨酸钠作用生成蓝色化合物，在,max=660nm,处比色测定，求出含氮量，计算蛋白质,（,2,）测定,:,标准曲线 吸取含氮,2.5g/ml,的硫酸铵,（,NH,4,）,2,SO,4,标准溶液,0,、,1.0,、,2.0,、,3.0,、,4.0,、,5.0ml,置于,25ml,容量瓶中，分别加入：空白酸溶液,2ml P76.3,（,2,）,、磷酸盐缓冲液,5ml,、加水至,15ml,、水杨酸钠,5ml,、,36,37,恒温水浴,15min,，加入次氯酸钠,2.5ml,，再在,36,37,恒温,15min,，加水至刻度,max=660nm,测,A ,样品处理：称取,0.2,1.0g,置于凯氏烧瓶中，加入,15ml,浓,H,2,SO,4,，,0.5gCuSO,4,，,4.5g,无水硫酸钠，小火加热沸腾后，进行消化，待溶液澄清，呈暗绿色时，冷却，移至,250ml,容量瓶中，定容。样品测定：吸取样液,5ml,（必要时稀释）以下步骤同上“标准曲线”操作,（,3,）计算,Xk,含氮量（）,=-100,蛋（）,=,总氮（）,F,（,6.25,）,m10,6,X-,含氮量,g,，,k-,样品稀释倍数，,m-,样品质量，,g,（,4,）说明：消化样品，当天测定，重现性好,.,严格控制反应温度（,36,37,）影响显色,（四）氨基酸总量测定,1,、双指示剂甲醛滴定法（测定游离氨基酸）,有单指示剂滴定法、双指示剂滴定法,单指示剂有：百里酚酞,酚酞,;,双指示剂有：中性红,百里酚酞,其原理均是用甲醛与,NH,2,作用，使碱性消失，再用强碱滴定,COOH,R-CH-COOH +2HCHO R-CH-COOH,NH,2,N,（,CH,2,OH,）,2,测定：样品（溶液）（,2030mg,氨基酸,+H,2,O+3,滴中性红，用,0.1N NaOH,滴定至黄橙色,（,V,1,）样品,+,中性甲醛,+3,滴百里酚酞，摇，静,1min,，用,0.1N NaOH,滴定至淡蓝色,（,V,2,）,计算：,（,V,2,V,1,）,C0.014,氨基酸态氮（,%,）,=-100,W,式中：,V,1,用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠的体积,V,2,用百里酚酞作指示剂滴定时耗氢氧化钠的体积,2,、电位滴定法,（,1,）原理：加入甲醛，固定氨基碱性。用酸度计指示滴定终点，据加入甲醛后耗用,NaOH,量计算蛋白质,适用于混浊及色深样品的直接滴定。,（,2,）测定：样液用,NaOH,滴定至,pH=7.5,8.2,加入中性,20,甲醛后，用,NaOH,滴至,pH=9.2,同时作空白试验,（,3,）计算：,氨基酸（）,=,3,、茚三酮比色法,（,1,）原理,氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用生成蓝紫色化合物，,max=570nm,其颜色深浅与氨基酸含量成正比。,（,2,）测定,准确吸取,100g/ml,氨基酸标准溶液,0.0,、,1.0,、,2.0,、,3.0,、,4.0,、,5.0,、,6.0ml,至比色管中，补加水至相同体积。加入茚三酮、磷酸缓冲液各,1ml,，水浴中加热,15min,。加水至（或转入容量瓶中）,25ml,，静置,15min,。在,570nm,下以空白液为参比液，测,A,，绘制标准曲线。,样品测定,吸取样液,1,5ml,，用同样条件下测,A,，查出氨基酸,g,（,3,）计算,X,氨基酸总量,（,mg,）,=-100,m1000,（五）个别氨基酸的测定,例：游离赖氨酸的测定,原理,赖氨酸与茚三酮在,pH,3,的专一显色反应，在,=475nm,处测,A,，分析范围,=0.075,0.2mg/ml,测定,a,标准曲线,在试管中分别加入赖氨酸标准溶液（,0.2mg/ml,）,0.75,、,1.0,、,1.25,、,1.5,、,1.75,、,2.0ml,各补足至,2.0mL,，加入,4mL,茚三酮试剂,=475nm,处，测,A,b,待测液测定,吸取待测液,2ml,，加,4mL,茚三酮试剂，,=475nm,测,A,（茚三酮试剂,茚三酮,1.25g+94mL,乙二醇甲醚；,+CuCl,2,2H,2,O 1.7g+32mL0.1M,柠檬酸）,作业：,1,、一般用什么方法测定食品中的蛋白质含量？写出其实验原理，实验步骤、计算方法。,2,、快速测定蛋白质的方法有哪些？（只要求写出测定方法名称,）,第五节 碳水化合物的测定,（一）测定方法概述,物理法（密度法、折光法、旋光法）,还原糖法（高锰酸钾法、直接滴定法、,单糖 蓝爱农法、斐林氏法、铁氰化钾法、,低聚糖 二硝基水杨酸比色法）,碘量法,(,测定醛糖）,色谱法 气相色谱法 液相色谱法,酶法 葡萄糖氧化酶,葡萄糖,半乳糖脱氢酶,半乳糖、乳糖,淀粉 水解成单糖,测定，旋光法,多糖 果胶 重量法，比色法,纤维 重量法,（二）可溶性糖类的提取和澄清,1,、提取液制备,（,1,）常用提取剂,水、乙醇,（,2,）提取液中含糖量控制,0.5,3.5mg/mL,（,3,）含脂肪食品先脱脂，然后用水提取,（,4,）含淀粉及糊精食品（乙醇沉淀淀粉等）用,70,75,乙醇溶液提取,（,5,）含乙醇及,CO,2,液态食品，蒸发至,1/3,1/4,原体积，以除去,C,2,H,5,OH,及,CO,2,（,6,）酸性食品应先中和防止低聚糖部分水解,（,7,）提取固体样品有时需要加热，以提高提取效果。一般在,40,50,，防止多糖溶出,（,8,）乙醇作提取剂加热时应安装回流装置,2,、提取液的澄清,（,1,）影响测定的杂质,色素、蛋白质、果胶、可溶性淀粉、有机酸、氨基酸、,单宁，可影响颜色、浑浊、过滤困难,（,2,）澄清剂,醋酸铅（中性）,Pb,（,CH,3,COO,）,2,3H,2,O,，形成沉淀，吸附杂质，可除去蛋白质、果胶、有机酸、单宁等。,乙酸锌和亚铁氰化钾二者生成氰亚铁酸锌吸附蛋白质等干扰物,硫酸铜和氢氧化钠,Cu,离子使蛋白质沉淀,（,3,）澄清剂用量,用量适宜，以无新沉淀为准，如,2ml,饱和醋酸铅（,30,）,（,4,）除铅剂,由于铅影响还原糖的测定，生成铅糖化合物,常用除铅剂有草酸钠、硫酸钠、磷酸氢二钠,（三）蓝,爱农（,Lane-Eynon,）法,测定还原糖,（国际上常用的定量糖的方法）,1,、原理,斐林试剂甲液（,CuSO,4,5H,2,O,）,斐林试剂乙液（酒石酸钾钠,+NaOH,）,甲、乙混合酒石酸钾钠合铜,酒石酸钾钠合铜,+,葡萄糖 ,葡萄糖酸,+Cu,2,O,（,红棕,）,终点的确定,：,葡萄糖,+,亚甲基蓝,（,氧化态,）,亚甲基蓝,（,还原态,）,过量 兰色 无色,（兰色消失）,终点时的颜色为：兰色消失了的红棕色,2,、测定,预测,准确吸取斐林试剂甲液,5.00mL,、乙液,5.00mL,锥形瓶中，至沸腾，再加入亚甲基蓝指示剂，在加热的条件下，用样液滴至蓝色褪尽。（先快后慢，要求很快达到终点，因为亚甲基蓝易被空气氧化为蓝色，且要求在加热的情况下以除去空气）,测定,甲液,5mL,、乙液,5mL,锥形瓶中，加入比上述预测量少,0.5,1ml,样液在,2min,内沸腾，维持沸腾,2min,，加入,3,滴亚甲基蓝指示剂，再在,3min,内滴定至蓝色褪尽。,3,、计算,F,还原糖,%,=-,100,(V,1,/V)m,m-,样品质量，,mg,；,V,1,-,滴定量,mL,；,V-,样液总,mL,；,F-,还原糖因素，,10mL,费林试剂，相当的还原糖量,mg,F,的求得有两种方法：,A,、用标准还原糖液用上面同样方法标定,10ml,费林试剂求得。,B,、查蓝,爱农法专用“还原糖因数表”附表,例 若,V,1,=26,则,F=49.9,（四）直接滴定法测定还原糖,1,、原理 （,GB/T5009.7-1985),斐林试剂甲液（,CuSO,4,5H,2,O+,亚甲基蓝），斐林试剂乙液（酒石酸钾钠,+NaOH+,亚铁氰化钾，混合酒石酸钾钠合铜，酒石酸钾钠合铜,+,葡萄糖葡萄糖酸,+Cu,2,O,（,红棕,），亚铁氰化钾使,Cu,2,O,（红棕）生成无色络合物,K,2,Cu,2,Fe(CN),6,。,Cu,2,O+K,4,Fe,（,CN,）,6,+H,2,O,K,2,Cu,2,Fe,（,CN,）,6,+2KOH,红棕,无色,终点的确定：葡萄糖,+,亚甲基蓝（氧化态）亚甲基蓝（还原态,过量 兰色 无色,2,、测定,碱性酒石酸铜溶液的标定,（乙液（内有亚铁氰化钾）,取甲、乙液各,5.00mL,，加入,9,9.5ml,葡萄糖标准溶液,(1mg/mL),，,2min,内沸腾，准确沸腾,30s,，滴至蓝色褪去，记下消耗葡萄糖,V,1,。,F=CV,1,（,F-10mL,斐林试剂相当于葡萄糖质量，,mg,；,C-,葡萄糖液浓度,mg/mL,；,V,1,-,葡萄糖液消耗体积）,预测：吸取甲、乙液各,5.00mL,，加水,10mL,，,2min,内至沸，准确沸腾,30s,，用样液滴定至蓝色褪去，记录,V,样液预测,测定：吸取甲、乙液各,5.00mL,，加入预测样液,V,少,1mL,样液，,2min,内沸腾，准确沸腾,30s,，继续滴定至蓝色褪去，记下,V,2,3,、计算,F,还原糖,%,=-,100,(V,2,/V)m,F-10mL,斐林试剂相当于葡萄糖质量，,mg,V,2,-,消耗样液的体积，,ml,V-,样液定溶的总体积，,ml,M-,样品的质量，,mg,思考题：为什么费林试剂甲液和乙液应分别存放，用时才混合？滴定时为什么要加热？,因为碱性酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会缓慢分解出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。,加热的目的：（,1,）加速还原糖与,Cu,2,+,的反应速度（,2,）次甲基蓝变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇氧气又会被氧化成氧化态次甲基蓝,，此外氧化亚铜极其不稳定，易被空气中氧气氧化，保持沸腾，防止氧气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化。,（五）高锰酸钾法测定还原糖,1,、原理 （,GB/T5009.7-1985),还原糖与酒石酸合钠反应生成,Cu,2,O,Cu2O+2Fe3+2H+2Cu2+2Fe2+H2O,10Fe2+2MnO4-+16H+10Fe3+2Mn2+8H2O,5mol Cu,2,O,相当于,2mol KMnO,4,由,KMnO4,耗量求出,Cu,2,O,量，,再由,Cu,2,O,检索表得出相当的还原糖量,2,、适用范围及特点,适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液不受限制，准确度高，重现性好，但费时，需检索表,3,、测定：,吸取样液,50ml,于烧杯中，加费林试剂甲、乙各,25mL,，,4min,内沸腾，,2min,趁热在古氏坩埚中抽滤，,60,热水洗涤去滤液。保留,Cu,2,O,，将坩埚用硫酸铁溶液,50mL,分数次将,Cu,2,O,溶解，滤入吸滤瓶中，热水洗涤，加入,20mL2 mol/L H,2,SO,4,，用,KMnO,4,溶液滴至微红色，同时作空白试验（,V,0,),4,、计算,X=C,MnO,4,-,(V-V,o),(5/2,）,143.08(M,Cu,2,O,),A,还原糖,(%)=-,1