生物制药-第五章.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2010,年,8,月,生物制药,温州医学院,生命科学学院,王慧利,内容,第一章,绪论,第二章 生物药物概论,第三章 生物制药工艺学,第四章 基因工程制药,第五章抗体工程制药,第六章 动物细胞制药,第七章 植物细胞制药,第八章 酶工程制药,第九章,海洋生物制药,第十章 利用现代生物技术改造传统制药工业,第五章 抗体工程制药,第一节 概论：,1,抗体概念,2,抗体产生细胞学基础,3,抗体特性,4,抗体结构及多样性,5,抗体形成的研究历史,第二节 抗体工程,1,多克隆抗体,2,单克隆抗体,3,基因工程抗体,4,抗体库,5,应用：抗体诊断试剂的研究,抗体治疗药物的研究,（,1,）抗体基本概念,第一节,概论,抗体,机体在抗原物质刺激下，由,B,细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白,。,1964,年，世界卫生组织举行专门会议，将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白（,Ig,）。如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血症、冷球蛋白血症等患者血清中存在的异常免疫球蛋白以及“正常人”天然存在的免疫球蛋白亚单位等。,因而免疫球蛋白是结构及化学的概念，而抗体是生物学及功能的概念,。,所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗体。,免疫球蛋白,具有免疫功能的血清组分，不一定具有抗体活性,要素：,B,细胞 产生，,免疫功能（与抗原结合）,球蛋白,免疫反应,（,2,）抗体的细胞学基础,免疫：,系指机体对感染有抵抗能力，而不患疾病或传染病。,组织和器官,免疫系统,细胞,免疫学,是研究免疫系统的结构与功能，理解其对机体有益的防卫功能和有害的病理作用及其机制，以发展有效的免疫学措施，实现防病、治病的目的。,活性分子,免疫分子（抗体，补体，细胞因子等）,免疫细胞：,(,淋巴细胞、粒细胞,及白细胞、浆细胞、肥大细胞等,),免疫器官：中枢免疫器官和周围免疫器,官；,A,中枢器官是免疫细胞发生和分化的场所,(,胸腺,-T,、骨髓,成血干细胞和鸟类法氏囊,-B),B,周围免疫器官是免疫细胞居住和发生场所,:,淋巴结、脾脏、黏膜相关的淋巴组织,-,分布于呼吸道、消化道,泌尿系统黏膜,1,免疫系统,免疫系统与免疫细胞,淋巴结网,淋巴管,左右锁骨下静脉并入血液循环,Thymus,Bone,Marrow,Waldeyer”s,ring,咽淋巴环,(lymph nodes,tonsils),扁桃腺,Bronchus-associated,Lymphoid tissue,Lymph nodes,（淋巴结）,Spleen,（脾）,Lamina,propria,粘膜下层,Mesenteric,Lymph node,肠系膜淋巴 结,Peyer”s,patch,Genitourinal,Lymphoid tissue,Lymph,nodes,皮耶氏节,生殖器淋巴 组织,胸腺,骨髓,免疫器官和组织的分布,免疫系统与免疫细胞,2,、免疫细胞：主要包括淋巴细胞、粒细胞和肥大细胞，单核巨噬细胞，树突状细胞。,免疫细胞 按表面分子标志及功能分：,T,细胞、,B,细胞、非,T,非,B,淋巴细胞,T,细胞,：,据表面带有,CD4,或,CD8,分子,分辅助性,T,细胞、,杀伤性,T,细胞、抑制性,T,细胞，参与,细胞免疫,。,B,细胞：,转化为浆细胞、产生抗体，参与,体液免疫,，,B1,和,B2,。,NK,（,natural killer,）,细胞,：,无需,辅助,细胞,或分子的参与，,即可直接杀伤病变细胞,。释放,穿孔素和颗粒酶,造成靶细胞死亡，也可通过肿瘤坏死因子杀伤靶细胞,B,细胞,骨髓,干细胞,B,前体细胞在骨髓中成熟释放,成熟,B,细胞 释放于淋巴系统,激活,B,细胞,分化成浆细胞，分泌,抗体,或记忆,B,细胞，形成免疫记忆,T,淋巴细胞,骨髓,干细胞（,类囊器官,),T,前体细胞进入胸腺，,成熟,T,细胞 释放于淋巴系统,激活,T,细胞,分化成,杀伤,T,细胞，,辅助,T,细胞,抑制,T,细胞,记忆,T,细胞,杀伤细胞,分泌细胞因子，辅助,B,细胞激活,或杀伤细胞,形成免疫记忆,抑制过敏反应,皮肤,T cell,淋巴瘤患者,Tc,细胞攻击肿瘤细胞扫描电镜像,(,体外培养实验 人工加色,),细胞杀伤,T,淋巴细胞,人,T,淋巴细胞攻击母细胞瘤细胞,T,辅助细胞介导,B,细胞的激活,巨噬细胞的吞噬作用,其它免疫细胞,中性粒细胞、血小板等,3,、免疫因子：主要包括膜表面免疫因子和体液免疫因子。,B,和,T,细胞表面有各自的特异性膜表面抗原受体,BCR,和,TCR,能识别特异性抗原并与之结合，启动特异性免疫。,体液免疫因子主要包括抗体、补体和细胞因子。细胞因子是,免疫细胞分泌的低分子的多肽,，包括白细胞介素（,IL,）集落刺激因子（,CSF,）干扰素（,INF,）肿瘤坏死因子,(TNF),及转化生长因子,(TGF),具有多方面调节作用；既有,细胞毒素和抗病毒,功能，直接参与免疫应答的效应过程,（,3,）抗体的特性,（,1,）结合特异性抗原：,抗体与其它免疫球蛋白分子最大区别就在于抗体能与相应抗原发生特异性结合，在体内导致生理或病理效应；抗体是靠其分子上的特殊的结合部位与抗原结合的。,（,2,）激活补体：,抗体与相应抗原结合后，借助暴露的补体结合点去激活,补体,系统、激发补体的,溶菌、溶细胞,等免疫作用。,（,3,）结合细胞：,不同类别的免疫应答,。,（,4,）可通过胎盘及粘膜：,免疫球蛋白,G,（,IgG,）能通过胎盘进入胎儿血流中，使胎儿形成,自然被动免疫,。免疫球蛋白,A,（,IgA,）可通过消化道及呼吸道粘膜，是粘膜,局部抗感染免疫,的主要因素。,（,5,）具有抗原性：,抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。,（,6,）抗体对理化因子的抵抗力与一般球蛋白相同,：,不耐热，,60,70,即被破坏。各种酶及能使蛋白质凝固变性的物质，均能破坏抗体的作用。抗体可被中性盐类沉淀。在生产上常可用硫酸铵或硫酸钠从免疫血清中沉淀出含有抗体的球蛋白，再经透析法将其纯化。,生物学活性,抗体结合抗原的活性,由,B,细胞产生的各种特异抗体与侵入机体的病毒或外毒素分子结合，从而阻断了病毒进入细胞的能力或中和了外毒素分子的毒性作用。,抗体产生的规律,（,1,）初次反应产生抗体,：当抗原第一次进入机体时，需经一定的潜伏期才能产生抗体，且抗体产生的量也不多，在体内维持的时间也较短。,（,2,）再次反应产生抗体,：当相同抗原第二次进入机体后，开始时，由于原有抗体中的一部分与再次进入的抗原结合，可使原有抗体量略为降低。随后，,抗体效价迅速大量增加，,可比初次反应产生的多几倍到几十倍，在体内留存的时间亦较长。,（,3,）回忆反应产生抗体：,由抗原刺激机体产生的抗体，经过一定时间后可逐渐消失。此时若再次接触抗原，可使已消失的抗体快速上升。若再次刺激机体的抗原与初次相同，则称为,特异性回忆反应,；若与初次反应不同，则称为,非特异性回忆反应,。非特异性回忆反应引起的抗体的上升是暂时性的，短时间内即很快下降。,（,4,）抗体的基本结构和多样性,基因多样性决定抗体多样性,免疫球蛋白反应的特异性和分子的多样性是受基因支配；一条肽链的,C,区和,V,区分别由,C,基因和,V,基因编码。任何一个,B,细胞都有,3,个独立的,Ig,基因簇：,1,个,H,链基因簇：,2,个,L,链基因簇：,和,共同构成,Ig,的结构基因,在,B,细胞分化成熟过程中进行,基因重排,，进而转录与翻译，形成抗体。,L,H,(5,）抗体的分类,（,1,）按作用对象,，,可将其分为,抗毒素,、,抗菌,抗体、,抗病素,抗体和,亲细胞,抗体（能与细胞结合的免疫球蛋白，如,1,型变态反应中的,lgE,反应素抗体，能吸附在靶细胞膜上）。,（,2,）按理化性质和生物学功能，,可将其分为,IgG,、,IgA,、,IgM,、,IgE,、,IgD,五类。,抗体的分类,5,大类：,IgG,-,是成人血清中的主要成分,(75%),新生儿具有的唯一一种抗体。,IgA,-,在血清中只有,15%,但从整个人体中是量最大的抗体（,66mg/kg/day,），,4,6,个月的婴儿就可以开始合成这种抗体。,IgM-,在血清中只有,10%,是最原始的也是最大一类（,b,（,5,聚体,),免疫系统启动时最早出现的抗体，也是,B,细胞上的受体,IgD-,20-30ug/ml,3d,是,B,细胞上的主要受体,IgE-,0.1-0.4ug/ml,3d,是引起超敏反应的主要原因。,hypersensitivity(allergic,过敏,),Immunoglobulins-Ig,(glycoprotein,按理化性质和生物学功能,(5,）抗体的分类,（,3,）按与抗原结合后是否出现可见反应,，可将其分为：在介质参与下出现可见结合反应的,完全抗体,，即通常所说的抗体。不出现可见反应，但能阻抑抗原与其相应的完全抗体结合的,不完全抗体,。,（,4,）按抗体的来源，,可将其分为天然抗体和免疫抗体。,抗体体内生成的理论,抗原刺激前，机体具有抗体初级库,抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发生克隆性增殖。,在抗原的反复刺激下，抗体的,V,区发生高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行类别转换，最终抗体成熟。,类别转换,(,仅在,C,区发生,DNA,水平上的改变，导致抗体的类别发生改变，,C,区决定五种基本类别，,第二节,抗体工程研究,大致可分为,3,个阶段,：,多克隆抗体阶段：,以,1890,年,发现白喉抗毒素为代表（,Bering,等），其,特点,是用抗原免疫动物来获得,多克隆抗体,。,单克隆抗体阶段：,以,1975,年,创建,杂交瘤技术制备,单克隆抗体,为代表（,Milstein,和,khler,）,。,基因工程抗体阶段：,以,1984,年,以基因工程方法制备抗体为代表，制造,基因工程抗体（,Morrison),1989,年,Winter,等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第,3,代抗体,基因工程抗体技术的发展,。,抗体工程,抗体工程,-,是指利用单克隆抗体技术和基因工程技术进行天然抗体的生产和抗体的改造，以用于治疗难治疗疾病。如恶性肿瘤、病毒性感染、传染性疾病、风湿性关节炎，自身免疫系统疾病等，另外新型研制的抗体往往可作为诊断试剂。,抗体工程,流程包括,一、免疫动物的选择：选择动物时应考虑如下因素：,1.,抗原与免疫动物种属差异越远越好。,2.,动物必须适龄、健壮、无感染。,3.,动物体内有与抗原相类似的物质或其它原因而使该抗原对该动物免疫原性极差，则该动物不能选用。例如：,IgE,绵羊，胰岛素,-,家兔，酶类,-,山羊等。,（,1,）多克隆抗体,免疫动物获得抗血清的途径一直是获得抗体的经典,传统方法,由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生,IgG,、,IgM,、,IgA,、,IgE,和,IgD,等五类抗体。,二、免疫方法,1.,免疫的剂量,：应考虑抗原性的强弱、分子量的大小、动物的状态和免疫时间。一般大,:0.5,1mg/,只，小,:0.1,0.6mg/,只。,2.,免疫途径,：,皮内或皮下免疫采用多点注射,(810,点,),。皮内注射易引起细胞反应，对提高抗体效价有利，但皮内注射较困难,(,因佐剂加入后粘度大,),；半抗原宜皮内多点注射。,用明矾作佐剂时，一般用于,肌肉注射,(,因皮下注射易引起肉芽肿和脓肿,),；,腹腔和静脉,注射多用于颗粒性抗原和加强免疫。,对宝贵抗原,，可采,用淋巴结内直接注射,抗原。,3.,免疫时间：,首次和二次免疫之间要间隔约,20,天，二次以后每次间隔,710,天,。第一次免疫后，机体处于识别阶段，若很快第二次注入抗原，极易造成,免疫耐受,。第二次以后，若间隔时间过长，则刺激变弱，造成抗体效价不高。,三、动物采血法：,1.,颈动脉采血法,2.,心脏采血法（常用于小动物）,3.,静脉多次采血法,四 抗血清的纯化、鉴定和保存,1.,抗血清的纯化,:,亲和层析、吸附法纯化特异性抗体。,用,40%,、,35%,、,33%,的硫酸铵盐析三次,(,或,20%,的硫酸钠,),粗提,-,球蛋白，但仍含,5%,的其它蛋白。,经离子层析、亲和层析纯,化,Ig,或酶解法制备,Fab,或,Fc,片段。,2.,抗血清的鉴定,：双扩（特异性、效价）,电泳（纯度）。,3.,抗血清的保存：过滤除菌后,。,A 4,液态保存,36m.,B 20-40,保存,23,年，但避免反复冻融。,C,冰冻干燥，,45,年。,多克隆抗体缺点,1,纯度低：,用来免疫动物的抗原可能含有多种抗原决定簇，因而进入机体后会产生多种抗体,2,获得的抗体是非人源抗体,2,单克隆抗体技术,一、单克隆抗体,-(monoclonal,antibody,McAb,),单克隆是指由一个细胞经无性繁殖而形成的遗传性状完全相同的细胞群。一个,B,细胞杂交瘤,产生的只识别一种抗原决定簇的抗体分子。,二、,杂交瘤技术,-,用人工方法使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞的一种技术。即将含有特,异免疫信息的淋巴细胞,与,具有无限增殖能力的肿瘤细胞,，在诱导物（,PEG,）的作用下，使其融合产生一个新的具有特异活性细胞及其产物的技术。,杂交瘤技术的原理：,动物细胞的融合技术,利用聚乙二醇,(PEG),作为细胞融合剂，使免疫的,小鼠脾细胞,(,能分泌某种抗体的,B,细胞,),与具有在体外不断繁殖能力的,小鼠骨髓瘤细胞,融为一体，在,HAT,培养基的选择作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的单个细胞培养,(,克隆化,),，,最终获得既能产生所需抗体、又能不断繁殖的杂交瘤,细胞纯系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其后产生的腹水中含有高效价的单克隆抗体。,亲本细胞：,免疫小鼠的脾细胞（,B,细胞）提供抗体,同系列小鼠的骨髓瘤细胞 提供单克隆繁殖体系,HAT,培养基是在常用的细胞培养基内添加了,3,种特殊成分：次黄嘌呤,(H),、,氨基蝶呤,(A),、,胸腺嘧啶,(T),。,1,.,脾细胞,：在体外,57,天内死亡，所以在,HAT,培养基中,最终死亡,。,2.,骨髓瘤细胞,：一般细胞合成,DNA,有两条途径：一条是主要途径，即由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成,DNA,，,此途径可被,氨基蝶呤,(A),所阻止。,另一条是替代途径：在次黄嘌呤,(H),和胸腺嘧啶,(T),存在下，由次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶,(HGPRT),和胸腺嘧啶核苷激酶,(TK),同时催化合成,DNA,小鼠骨髓瘤细胞为,HGPRT,缺乏的缺陷型细胞,，在,HAT,中，正常合成,DNA,的途径被氨基蝶呤,(A),阻断，又因,HGPRT,缺乏而不能用替代途径，,最终只能死亡,。,3.,杂交瘤细胞,：合成,DNA,的途径阻断，但可利用原脾细胞的,HGPRT,完成替代途径的作用，,存活,。,筛选杂交瘤细胞的,HAT,培养基：,HAT,选择培养基选择杂交瘤细胞原理示意图,HAT,培养基是在常用的细胞培养基内添加了,3,种特殊成分：次黄嘌呤,(H),、氨基蝶呤,(A),、胸腺嘧啶,(T),。,肿瘤细胞缺少,HGRRT,脾细胞：,在体外,57,天内死亡,只有杂交瘤细胞在这种条件下可以永久存活,单克隆抗体,McAb,特点,1,、,McAb,以其纯度高、单一特异性，与一个抗原决定簇反应,2,、可重复性，能提供完全一样的抗体制剂,3,、一经制出可大量的供应；,4,、生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；,5,、灵敏性高等优点，能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。逐步取代了多克隆抗体试剂，减少了血清学上的,交叉反应,，提高血清学实验诊断特异性和敏感性，,McAb,高度的生化均一性和生物活性单一性。,主要临床应用,1,病原微生物抗原的检测。,2,肿瘤抗原的检测。,3,免疫细胞 及其亚群的检测。,4,激素测定。,5,细胞因子的测定。,目前在美国单克隆抗体类药物已占,FDA,所批生物药的,3/4,。,美国已上市,16,种单克隆抗体药物,2002,年销售额,29,亿美元,2005,年,90,亿美元,我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段,用作药物：,1,单克隆抗体具有导向治疗作用,McAb,具有高度的特异性，,能准确识别靶器官上的特异性抗原决定簇,。将治疗药物等细胞毒素制剂与肿瘤抗原,McAb,相结合，利用,McAb,的导向作用，将药物或毒素携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为,“,免疫导弹,”。,药物分子,McAb,靶细胞，如肿瘤,存在问题,以单克隆抗体作为载体,的药物可对肿瘤进行,定向治疗。,其障碍有,：,单克隆抗体均是,鼠源性抗体,，应用于人体内可产生,人抗鼠抗体（,HAMA,）,，,加速了排斥反应,，在人体内的,半衰期,只有,5,6,小时,，难以,维持有效药物作用靶组织时间。,完整的抗体分子（即,Ig,）的相对,分子质量过大,，,难以穿透实体肿瘤组织,，达不到有效的治疗浓度,改造,：,降低单克隆抗体的免疫原性,；,降低单克隆抗体的相对分子质量,基因工程抗体,3,基因工程抗体,概念：,利用基因工程技术，将特定的抗体的编码基因克隆到适当载体上，转移到合适表达细胞中，进行大量表达，从而获得的抗体称为基因工程抗体,基因工程抗体主要分两大类，即,大分子抗体,和,小分子抗体,。前者目的是使鼠单抗人源化（含有部分来自于人的抗体基因）；而后者则是使抗体具有更好的通透性，易于到达靶部位。,V,区,C,区,人的,IG,鼠的,IG,嵌和体,导入表达细胞大量表达,产物提取和分析,骨髓瘤细胞中,80,年代，开始研究抗体生产的人源化,嵌合抗体,.,用人抗体的,C,区替代鼠抗体的,C,区，并可延长其在体内的半衰期及改善药物的动力学。属第一代,人源化抗体,（,HAb,）,1,、获取目的基因,一般都是提取杂交瘤细胞系的,mRNA,经反转录,PCR,（,RT,PCR,）,获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区（,V,H,和,V,L,）,基因。,2,、与合适载体连接在一起,根据将要表达的细胞来选择合适的表达载体，这些载体必须高效表达，对细胞本身无害，又带有选择标记。,3,、基因工程抗体的表达,导入表达细胞，筛选阳性克隆后，按其目的不同，可选用,原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物,等不同表达方式进行表达。,基因工程抗体技术的步骤,A,、原核细胞表达,融合表达抗体末端附加一段其它肽段（如膜蛋白），作为标签，有利于对抗体文库进行,淘筛,，且有利于对克隆和抗体活性进行鉴定。（产物定位于细胞膜上）,分泌型表达利用,琥珀终止密码（,TGA,）的终止作用,，在无琥珀抑制基因的菌株中进行表达，形成可溶性抗体。,B,真核细胞表达,用于表达基因工程抗体的真核细胞有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌等，而且这些细胞的表达都是分泌型表达。真核细胞表达抗体的方式在病毒病的防治和基因治疗上有重要价值。,C,转基因植物表达,即将人的,Ig,基因组转移到植物体内，让植物产生人源化抗体,D,转基因动物表达,即将人的,Ig,基因组转移到动物体内，让动物产生人源化抗体。,4,抗体库技术,1,，,1989,年英国剑桥,Winter,小组与,Scripps,研究所,Lerner,小组采用,PCR,克隆到,全部抗体基因,或,将,Ig,的重链和轻链的基因片段随机配对克隆入适当的人工载体，,并重组于,原核表达,细胞中。以标记抗原即可筛选到相应抗体，当时成为,组合抗体库技术,抗体库技术,是抗体工程研究领域的一次新飞跃。之前，基因工程抗体技术只能对已有的单抗进行改造，而,抗体库技术的诞生,却可以不通过,动物免疫,和,细胞融合,便可以从抗体库中筛选得到全新的人源化的抗体，并通过细菌发酵或转基因动植物生产出来。,抗体库技术的发展使得抗体工程技术进入了一个全新的时期。,噬菌体抗体,-,90,年代初，抗体基因与单链噬菌体的外壳蛋白融合并表达于,噬菌体表面,，以,固相化的抗原,吸附相对应的,噬菌体抗体,，经过多次吸附洗脱扩增，即可得到所需要抗体，称噬菌体抗体。,5,、,噬菌体抗体库技术,将抗体全套可变区基因组装到噬菌体载体,并表达,于,噬菌体表面,所得到的多样性噬菌体抗体的集合，称为噬菌体抗体库。,利用噬菌体抗体库，筛选并富集特异性抗体的过程，称为噬菌体抗体库技术。,噬菌体抗体库技术的特点,基因型和表型相统一,选择能力和扩增能力相结合,噬菌体抗体库的构建,筛选流程,+,噬菌体抗体库,抗原,再循环,放大,结合与洗涤,洗脱,二、,噬菌体抗体库技术的特点,基因工程抗体的延伸,1,、模拟天然全套抗体库,抗体文库可以达到或,超过,10,11,库容,，建库的外源基因,来自人体外周血、骨髓、骨髓细胞或脾脏的淋巴细胞,提取的,mRNA,反转录形成的,cDNA,扩增,，这是人体多克隆细胞的总,mRNA,。,使用的,通用引物,采自多个人体，具有,人的种属普遍性,。抗体的,V,H,和,V,L,基因的,随机重组,也增加了,抗体的多样性,。能模拟天然全套抗体库。,2,、避开了人工免疫和杂交瘤技术,由于,抗体库,的大容量和极高的,筛选效率,，使得可以,调出任意抗体基因,。因而能免除了,人工免疫动物（,多克隆抗体,),和细胞融合技术,（单克隆抗体,),。,3,、可获得高亲和力的人源化抗体,在噬菌体抗体库技术中,V,H,和,V,L,基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又都来自人体，因此，所产生的抗体必然,都是高亲和力的人源化抗体。,基因工程抗体及抗体库的优点：,（,1,）通过基因工程技术改造，可以降低抗体的免疫原性，使,抗体人源化,，消除排斥（,HAMA,）反应；,（,2,）基因工程抗体的,分子质量较小,，更利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位，从而改善其体内药代动力学性质；,（,3,）利用,抗体库,技术,，不需用抗原免疫动物便可以获得针对任何一种抗原决定簇的抗体，甚至制备出用单克隆抗体技术无法实现的新型抗体：,（,4,）可以采用原核、真核表达系统以及转基因动植物生产出大量的基因工程抗体，降低了生产成本。,小鼠抗体,嵌合抗体,重构抗体,人源抗体,抗体人源化,5,抗体应用,抗原抗体特异性结合,，在体内或体外均可呈现某种反应。,(1),体内用作治疗药物,，可表现为,溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素,等作用。,(2),体外,作为诊断试剂,，由于抗原性状和反应条件不同，可发生,凝集或沉淀等可见反应,，故,可用已知抗体来鉴定抗原,，做,病原学的诊断和血型测定,，称为,血清学鉴定，即,作为诊断试剂,。,从,20,世纪,40,年代开始，现代免疫学有了迅速地发展，逐渐形成了,3,大类抗体诊断药物，,血清学鉴定用的抗体制剂、,免疫标记技术,用的,抗体制剂,体内导向诊断药物,。,其中体外试验用的，习惯上称为,试剂,，体内导向诊断用的，则称为,药物,。,（一）抗体诊断试剂,血清学鉴定用的抗体类试剂,血清学鉴定,是指用已知抗体来鉴定未知的,抗原型,，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。,常用的方法,是,凝集反应。,用于,病原菌诊断,癌胚抗原测定,妊娠免疫诊断,不完全血型抗体检查,等。,乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂,原理,是，,红细胞经甲醛处理后,，在,酸性条件下能吸附蛋白质,，当纯化的抗,HBs,血清,吸附其上时便,具有抗体活性,，若待测样品中存在有,HBsAg,时，则发生特异性结合而使,血细胞发生凝集,。,病原微生物,抗体,红细胞,观察：,红细胞凝集,妇女妊娠后，血液和尿液中的,绒毛膜促性腺激素（,HCG,）,含量增高,，在,3,个月内可达到高峰,。,测定尿液中的,HCG,，,就可以确定妇女是否怀孕。,方法很多，其中，放射免疫测定法最灵敏，胶乳间接凝集试验法,最简便,。用,胶乳试剂测定,HCG,，,妊娠诊断试剂,ABO,血型检测,重要的是,ABO,血型系统,。按人红细胞表面带有的,A,或,B,种凝集原，可将血型分为,A,、,B,、,AB,和,O,型,4,种,，血清中含有的凝集素类型见下表。输血时，输入的红细胞凝集原可与受血者血液中的凝集素发生凝集反应，所以必须预先验血型,A,型血,红细胞上含有凝集原,B,凝集原,A,凝集原,B,型血,A,和,B,凝集原,AB,型血,无凝集原,O,型血,血清中,B,凝集素,A,凝集素,无凝集素,A,和,B,凝集素,输血,凝集反应,A,B,AB,O,A,B ,AB,O,A,B ,AB,O,万能输血者,万能受血者,A,B,AB,O,输血,凝集原,受血,凝集素,输血,凝集原,输血,凝集原,输血,凝集原,受血,凝集素,受血,凝集素,受血,凝集素,二、免疫标记技术用的抗体类试剂,给抗体标记,放射性核素、荧光素或酶活性,，,能将抗原抗体反应放大,，使常规方法不能观察的反应得以,显现,，因而,大幅度提高抗原抗体反应的,敏感性,，用于,对微量抗原物质进行定性或定量检测,。,结合,显微镜或电子显微镜,技术，还能对抗原物质作出,组织内或细胞内,的,定位测定,。除用于临床诊断之外，还能为,探讨发病机制提供有力的研究手段,。免疫标记技术有,3,种基本类型,：,免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫技术。,标记分子,抗体,抗原,放射性核素,荧光素,HRP,，,酶,信号放大,1,、荧光抗体诊断试剂,荧光抗体,是用荧光色素，如,异硫氰酸荧光素（,FITC,）、,罗丹明（,RB200,）、,藻红素（,PE,）,等标记,抗体球蛋白,，即成为,荧光抗体,。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在,荧光显微镜,下成为发光的,可视物,，从而达到诊断或定位的目的。,标记分子,抗体,抗原,只需标记二抗，可检测多种抗原,标记后只可检测一种抗原,2,、免疫酶抗体诊断试剂,免疫酶技术,是用,酶标记抗体来检测抗原,的方法，本法分为,免疫酶染色（组化法）,和,酶免疫测定（,EIA,）,两种类型。,（,1,）,免疫酶染色法：,当,加入酶的底物时，底物在酶的催化作用下发生反应，产生,有色物质,。该物质不需特殊仪器，在,光学显微镜下即能观察,。,（,2,）,免疫酶测定法：,用酶标记已知抗体或抗免疫球蛋白（抗抗体）,，与待查配体抗原混合反应,形成抗原抗体结合物后,，加入酶的底物进行显色，根据呈色程度使用,分光光度计,测知待测物质的含量,近年来发展起来的,酶联免疫吸附试验是酶免疫测定在方法上的一个重大,改进，其特点是利用抗原或抗体等蛋白质容易,吸附于聚苯乙烯塑料,等表面的性质，使,抗原抗体,反应在塑料管壁表面上进行,，从而,大大简化了抗原抗体结合物的分离手续,。本法用途广泛，敏感性高，既可定性,检测微量抗原,，也可定量,测定微生物成分、激素等微量抗原物质,。,（,ELISA,）,enzyme linked,immunosorbent,assay,酶联免疫吸附试验,固相抗体,待测标本,含抗原,酶标抗体,E,E,酶催化的底物,无色,E,酶催化形成的产物,带色的,洗去多余标本,洗去多余酶标抗体,双抗体夹心法测定抗原,洗去多余抗体,酶免疫检测仪测量产物颜色的光密度，就可定量测定抗原,三、导向诊断药物,肿瘤,放射免疫显像,为导向治疗的临床应用提供基础。,1,、是将抗肿瘤单克隆抗体（,Ab,）,与,二乙基三胺五乙酸（,DTPA,）,在,体外偶联成,Ab,DTPA,，,再注人体内后，就能与肿瘤组织相结合。由于,抗体分子量较大,，这一过程需,3,天才能完成,。,2,、,3,天后注入半衰期短的,放射性核素,In,113M,（,半衰期,100 min,）。,由于原先注人的,DTPA,是重金属离子络合剂,，所以,In,113M,就可以结合到,DTPA,分子上，从而使,肿瘤组织显像,。这一过程在,2h,之内即可完成。,DTPA,Ab,注入人体,DTPA,Ab,肿瘤组织,放射性核素,In,113M,（,DTPA,Ab,肿瘤组织,肿瘤组织显像,放射性核素,1,、导向诊断药物的优点,有以下几个：,在体内有确切定位肿瘤的作用，,准确性,可达,90,以上,，,灵敏度,几乎达,100,。,在体内可,检出,0.5cm,大小,的病灶,，并可检出肺、脑等部位的转移灶。,小分子抗体,容易到达,肿瘤部位，可明显提高,T,（,肿瘤组织）,/NT,（,非肿瘤组织）值,。,抗体在肿瘤部位，,可,保留,6,9,日,。,能观察,抗体在血中的,半衰期,和可能出现的,不良反应,。,2,抗体治疗药物,以抗体为载体的导向治疗药物的研究,已有,近,20,年的历史,，已制备出,百余种单克隆抗体,，,鉴定出数十种与肿瘤相关的抗原,，,但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。,单克隆抗体与毒素的偶联物,治疗淋巴瘤效果最佳，但,有效率仅达,30,左右,，处于,临床二期试验中,。,原因：,1,、,抗体相对,分子质量大,，,穿透力低,，,不,能到达靶部位或其摄取量低,2,、鼠源性单克隆抗体的,排斥反应,。所以目前正致力于,抗体小型化和人源化,的研究,3,、放疗药物,放射性核素标记的抗体治疗药物,抗体作为,放射性核素的导向载体,，,在人体内应用是比较成功的。,放射性核素标记的抗体有较大的杀伤范围，这有利于克服肿瘤,表面抗原的异质性,，对肿瘤细胞的杀伤也,不依赖抗原抗体结合后的吸收作用,，,放射性核素标记的抗体的,分子量又小,，,更容易穿透到达肿瘤部位,。,其缺点是有些放射性核素来源困难，且需放射性保护和污物处理。,已,批准上市的单抗,适用病症,靶,抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,移植排斥,大肠癌,冠心病,淋巴瘤,移植排斥,炎症性肠病、类风湿,CD3,17-1A,血小板受体,ba,CD20,CD25,TNF-,OKT3,Panorex,ReoPro,Rituxan,Simulect,Remicade,鼠单抗,鼠单抗,人鼠嵌合抗体,人鼠嵌合抗体,人鼠嵌合抗体,人鼠嵌合抗体,1986,1995(,德国,),1994,1997,1998,1998,、,1999,适用病症,靶,抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,移植排斥,乳腺癌,RVS,感染,AML,CLL,CD25,HER-2,RSV F,蛋白,CD33,CD52,Zanapax,Herceptin,Synagis,Mylotarg,CAMPATH,人源化抗体,人源化抗体,人源化抗体,人源化抗体化疗药物交联物,人源化抗体,1997,1998,1998,2000,2001,正在进行临床开发中的基因工程抗体,适用病症,靶,抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,银屑病,IL8,CD11a(IgG1),ICAM-3,CD80,CD2,CD3,ABXIL8,Anti-CD11a,ICM3,IDEC-114,MEDI-507,Smart anti-CD3,Human(,人源,),Humanized(,人源化,),Humanized,Primatized,Humanized,Humanized(IgG),，,临床前,/,适用病症,靶,抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,风湿性关节炎,Complement(C5),TNF-,TNF-,TNF-,CD4,CD4,5G1.1,D2E7,CDP870,Infliximab,IDEC-151,MDX-CD4,Humanized,Human,Humanized(,Fab,),Chimeric(IgG1)(,嵌合,),Primatized,(IgG1),Human(IgG),FDA,批准（,1999,）,思考题,抗体是怎样产生的？有什么特征？,单克隆抗体和抗体库技术基本原理是什么？,如何看待抗体工程研究的意义？,第五章就到这里了！,