生物化学和分子生物学3.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,重组,DNA,技术,生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：,（,1,）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；（,2,）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。,生物技术将是未来经济发展的新动力,第一次技术革命工业革命解放人的双手,第二次技术革命信息技术扩展人的大脑,第三次技术革命生物技术改造生命本身,基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程,此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术,直接相关联的学科：分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、生物信息学、化学工程学、医药学等。,对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术,生物技术的主要内容,基因工程亦称遗传工程，即利用,DNA,重组技术的方法，把,DNA,作为组件，在细胞外将一种外源,DNA,（目的基因）和载体,DNA,重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因,DNA,在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（,cloning,，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。,基因重组技术作为分子生物学最重要、最基本的技术之一，是许多分子生物,生物化学和细胞生物学实验实施的基础。,现代基因工程的创始人,P,伯格,（美国,1926,）在,1960,年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？,1972,年，伯格把两种病毒的,DNA,用同一种限制性内切酶切割后，再用,DNA,连接酶把这两种,DNA,分子连接起来，于是产生了一种新的重组,DNA,分子，首次实现两种不同生物的,DNA,体外连接，获得了第一批重组,DNA,分子，这标志着基因工程,技术的诞生。伯格因此获得了,1980,年诺贝尔化学奖,。,1973,年，美国斯坦福大学教授,S,科恩,和加州大学旧金山分校教授,HW,博耶,将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。,科恩随后以,DNA,重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。,1977,年，吉尔伯特（,W,Gilbert,）分别将编码,胰岛素和干扰素,的,DNA,经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素,。,基因工程的应用,重组,DNA,操作,一般,步骤：,（,1,）获得目的基因；,（,2,）,克隆,:,目的基因,与载体连接，形成重组的,DNA,分子,；,（,3,）,转化：,用重组,DNA,分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；,（,4,）,筛选：,对转化子筛选和鉴定；,（,5,）大量,培养：,对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,DNA,重组的基本模式,分（离目的基因）,切（割目的基因和载体）,接（连目的基因和载体）,转（化宿主细胞）,筛（选阳性克隆）,表（达目的基因）,“,纵向,”,体系,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,(,分,)-,目的基因及载体的分离,获得需要的目的基因常用的方法：,（,1,）化学合成,（,2,）基因组文库,(genomic DNA library),（,3,）,cDNA,文库,（,4,）聚合酶链式反应（,PCR,）,化学合成,根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。,较短的核酸片段（,60-80bp,）,多肽链的氨基酸顺序,mRNA,的碱基排列顺序,相应的基因结构,化学合成目的基因,化学合成的不足之处在于：（）要已知基因的核苷酸顺序；（）基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；（）价格昂贵。,化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。,用途：,PCR,引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针,基因组文库,细胞内总,DNA,的提取分离与基因组文库的构建,基因组,DNA,：在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体,DNA,（染色体,DNA,）和线粒体,DNA,的全部序列。,基因组文库,基因组文库是含有某种生物全部基因片断的,DNA,克隆群体。直接从生物体中提取总,DNA,，用超声或酶处理，将染色体,DNA,切割成片断，插入载体，转入受体菌扩增，得到基因组,DNA,文库，从中调用目的基因；,缺点,:,结构基因只含基因组很小一部分，有重复序列，假基因。真核生物基因组有内含子。这些给从基因组克隆目的基因带来困难。,细胞内总,DNA,的提取分离,程序,苯酚沉淀蛋白质,乙醇浓缩,DNA,组织或细胞染色体,DNA,基因片断,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,将总,DNA,经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的,DNA,片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。,基因组,DNA,文库,cDNA,文库,cDNA,文库的构建,mRNA,反转录酶,cDNA,(,互补,DNA,）,DNA,聚合酶,第二条,DNA,链,用细胞总,mRNA,，制备全套双链,cDNA,后，建立的基因文库。简称,c,DNA,文库。,以,mRNA,为模板，用反转录酶，合成与,mRNA,互补的,cDNA(complementary DNA,cDNA),片段，插入载体，转入受体菌扩增，得到,cDNA,文库；,比较基因组文库与,cDNA,文库,构建基因组文库获取目的基因,存在的问题,费时费事,内含子序列,反转录人工合成互补,DNA,方法的优势,不含内含子序列,获取的,DNA,片段往往是具有特定功能的目的基因,将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术,PCR(Polymerase,chain,reaction)-,聚合酶链式反应,分子生物学，医学，考古，法医,美国,Mullis,教授,1988,年发明了,PCR,技术,1993,年获得诺贝尔奖,聚合酶链式反应,（,polymerase chain reaction,PCR,）,聚合酶链式反应,（,polymerase chain reaction,PCR,）,Polymerase Chain Reaction,载体,DNA,的选择,可转移性,为目的基因提供进入受体细胞的,转移,能力。,合适的复制位点,为目的基因提供在受体细胞中的,复制能力或整合能力。,多克隆位点：广泛、特异,选择标志，便于筛选和鉴定,分子较小，可容纳较大的外源,DNA,理想载体的基本条件：,质粒,噬菌体,腺病毒载体,逆转录病毒载体,种类：,质粒载体的一般结构,存在于细菌染色体外的小型环状,DNA,分子。,具有,自我复制,功能。,带有抗性基因及表型识别等,遗传性标记物,。,经改造后具有,多克隆位点。,DNA,重组的基本模式,分（离目的基因）,切（割目的基因和载体）,接（连目的基因和载体）,转（化宿主细胞）,筛（选阳性克隆）,表（达目的基因）,“,纵向,”,体系,切,-,限制性内切酶酶切,限制性内切,酶酶切,酶切,载体和目的基因的切断,通常采用限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease),，简称限制酶，分别对载体,DNA,和目的基因进行切断，以便于重组。,限制酶目前已经发现,400,多种，所识别的顺序往往为,4-8,个碱基对，且有回文结构。,由限制酶切断后的末端可形成平端、,3-,突出粘性末端和,5-,突出粘性末端三种情况。形成粘性末端,(cohesive end),者较有利于载体,DNA,和目的基因的重组。,DNA,重组的基本模式,分（离目的基因）,切（割目的基因和载体）,接（连目的基因和载体）,转（化宿主细胞）,筛（选阳性克隆）,表（达目的基因）,“,纵向,”,体系,接,-,载体和目的基因的,连接,即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的,DNA,分子。,（一）粘性末端连接法：,当载体,DNA,和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入,DNA,连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。,较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。,载体,DNA,与目的基因的连接,（二）人工接尾法：,即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。,此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的,3-,端，如载体上添加一段,polyG,，则可在目的基因上添加一段,polyC,，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由,DNA,连接酶连接。,（三）人工接头连接法：,将人工连接器（,linker,即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子,DNA,片段,约,1020,个核苷酸，）连接到平末端,DNA,分子,(,载体和目的基因,),上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。,这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。,DNA,重组的基本模式,分（离目的基因）,切（割目的基因和载体）,接（连目的基因和载体）,转（化宿主细胞）,筛（选阳性克隆）,表（达目的基因）,“,纵向,”,体系,转,-,重组体的转化,受体细胞,重组体的转化,宿主菌或受体细胞,真核系统,酵母菌酵母,昆虫细胞,哺乳动物细胞,原核系统,大肠杆菌,枯草杆菌,原核细胞的转化（细菌转化）,受体细胞的选择,限制缺陷型,:,避免修饰和降解,重组缺陷型：,避免重组整合,转化亲和型：,较高的可转化性,遗传互补型：,利于筛选,感染缺陷型：,防止感染,感受态细胞,（,competent cell,）,所谓感受态，就是细菌吸收转化因子的生理状态。,如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源,DNA,。,受体细胞经过一些特殊方法,(,如电击法,CaCl2,等化学试剂法,),的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源,DNA,分子进入的感受态细胞,(Competent cells),。,大肠杆菌细胞,大肠杆菌感受态细胞,得到噬菌斑或单菌落,与重组,DNA,共同冰浴,而后,42,短暂热刺激,CaCl,2,处理,受体细菌,50-100mmol/L,CaCl,2,感受态细菌,重组体转入细菌,转化,E.coli,的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源,DNA,进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高,23,个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。,转化方法,真核细胞的转染,受体细胞系统,永生细胞系,细胞特异性的选择标记,对抗某种药物,电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。,转,染,方法,磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将,DNA,溶液加入到,CaCl2,中，然后在强烈震荡下加入由,Na2HPO4,和,NaH2PO4,组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将,DNA,包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将,DNA,导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免,DNA,被细胞内的核酸酶水解。,磷酸钙介导的转染,重组体,+,磷酸钙微粒,内吞作用,重组体进入细胞,大颗粒,基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将,DNA,溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使,DNA,吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。,激光微束穿孔法：利用直径很小、能量很高的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使,DNA,进入细胞。,显微注射法：利用毛细管直接将,DNA,注入细胞内。,脂质体（,liposome,）介导法：将,DNA,包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将,DNA,导入细胞内。,多聚物介导法：利用多聚物如,PEG,、二乙胺乙基葡聚糖（,DEAE,葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离子、,DNA,混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。,DNA,重组的基本模式,分（离目的基因）,切（割目的基因和载体）,接（连目的基因和载体）,转（化宿主细胞）,筛（选阳性克隆）,表（达目的基因）,“,纵向,”,体系,重组体克隆的筛选与鉴定,转化后的克隆群体：,阳性重组子的,筛选与,鉴定,1,、,遗传检测法,(,根据重组载体的标志作筛选,),-,插入失活法,-,互补法,2.,限制性酶切法,3.PCR,法,4.,杂交筛选法,5.,免疫学方 法,6.,核苷酸序列测定法,遗传检测法,菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。,对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用,插入灭活法,进行筛选。如,pBR322,中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。,如果外源,DNA,插入，氨卞青霉素抗性基因失活,如果外源,DNA,插入，四环素抗性基因失活,pBR322,质粒结构,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp,平板,Tet,平板,-,互补法,蓝白筛选,现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有,半乳糖苷酶基因（,lacZ,）的调控序列和,N,端个氨基酸偏码区（全长,1201,氨基酸）。这个编码区中插入一个多克隆位点。,受体菌是,Z,基因突变型，只含编码,半乳糖苷酶端的序列。当外源基因插入时，在,IPTG,（异丙基硫代,-D-,半乳糖苷）诱导下合成,半乳糖苷酶,N,端片断,和受体菌的,C,端片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的,半乳糖苷酶,称,互补。,具有,互补的细菌培养在含,IPTG,及,X-gal,（,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-D-,半乳糖苷）的培养基上,.X-gal,本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的,5-,溴,-4-,氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。,而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，则不能产生,互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。,IPTG,起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。,-,互补法,限制性酶切法,经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其,DNA,，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的,PCR,扩增片段,PCR,法,利用的目标引物,(,例如分离目的基因所使用的引物,),抽提需要筛选的克隆的重组,DNA,作为模板,进行,PCR,扩增,根据是否扩增出目的片段来确定阳性克隆,.,杂交筛选法,为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的,DNA,片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。,32,P,标记的,DNA,分子探针,杂交,放射自显影法,分子杂交,依据：碱基互补配对原则,合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记）,升高温度或改变,pH,使,DNA,变性,分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库中的一个,DNA,片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。,步骤：,免疫化学检测法,滤膜（固定抗体）,+,DNA,序列分析法,该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。,ACTGAAGGCT,DNA,重组的基本模式,分（离目的基因）,切（割目的基因和载体）,接（连目的基因和载体）,转（化宿主细胞）,筛（选阳性克隆）,表（达目的基因）,“,纵向,”,体系,外源基因在宿主细胞中的表达,重组子,目的基因的,mRNA,表达蛋白质,大肠杆菌（,E.coli,）,受体细胞,外源基因在宿主细胞中的表达,原核生物基因结构和表达特点,原核生物染色体,DNA,是裸露的环形,DNA,，其转录和翻译是偶联的连续进行。,原核生物形成多顺反子,mRNA,：,mRNA,在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。,3,、一般不含内含子（,intron,），没有转录及翻译后加工系统,。,4,、,原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成,操纵子,。,操纵子,是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位,。,启动子,(promoter,P,),是指能被,RNA,聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段,DNA,序列。,一般长,40-60bp,，富含,A-T,碱基对,具有保守序列：,-10,区（,pribnow box,）：,TATAAT,-35,区：,终止子（,terminator,，,T,）,:,位于基因,3,端,给予,RNA,聚合酶转录终止信号的,DNA,序列,5,、原核生物中参与转录的基因结构：,翻译起始密码子,AUG,或,GUG,SD,顺序（,shine-dalgarno,）：,AUG,上游,3-11 bp,长约,3-9bp,mRNA,与,16s,核糖体亚基间的识别与结合序列,6,、与翻译有关的原核细胞结构：,核糖体结合位点,人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有几十年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的,80%,。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。,设计外源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因在大肠杆菌中表达所需要的元件，,包括转录起始必需的启动子,、,翻译起始所必需的核糖体识别序列,等,；外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有,诱导性表达所需要的元件,，即有,操纵子序列以及与之配套的调控基因,等；外源基因还应当插入到适合于表达的位置，所以表达载体中要设有适合的,多克隆位点,；此外还应,具备基因克隆筛选的条件,，包括在细胞中复制必需的,复制起始序列,、,筛选标志,如抗药性基因等。,原核表达载体,(expressing vector),特点：带表达构件,转录和翻译所需的,DNA,序列,大肠杆菌表达载体：含启动子,核糖体结合位点,克隆位点,转录终止信号,启动子：,trp-lac(tac),启动子、,噬菌体,P,L,启动子、,T7,噬菌体启动子,核糖体结合位点,(ribosome-binding site,RBS),：起始密码子,(ATG),和,SD,序列,转录终止序列,影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：,启动子,终止子,SD,mRNA,多肽链,原核表达系统的缺点,没有真核转录后加工的功能，不能进行,mRNA,的剪接，所以只能表达,cDNA,而不能表达真核的基因组基因；,没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；,表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体（,inclusion body,），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量,10%,时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。细菌裂解后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初步纯化，但无生物活性的不溶性蛋白，要经过复性（,renaturation,），使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质，常常是一件很困难的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。,真核表达系统的必要性及优势,1.,具转录后加工系统,2.,具翻译后修饰系统,3.,可实现真正的分泌表达,4.,基因治疗,基因载体,目的基因,质粒 噬菌体 病毒,PCR cDNA,化学合成 基因组文库,限制性内切酶,有切口的载体,有切口的目的基因,DNA,连接酶,重组体,转化 转染 体外包装,带重组体的宿主细胞,表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法,目的基因的表达,基因工程用于生产蛋白质类药物,治疗糖尿病的,胰岛素,，是一种,51,个氨基酸残基组成的蛋白质,1982,年美国,EliLilly,公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为,(Humulin),。,干扰素,用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗效。,1,升发酵液中所得的干扰素相当于过去从,1000,升人血中所得。生产成本也大为降低。,目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前本不可能大量生产的,生长因子,，,凝血因子,等蛋白质药物，现在用基因工程办法便可能大量生产。,