化学生物学-化学物质与核酸的相互作用.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,熟练掌握,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第八章,化学物质与核酸的相互作用,化学物质,核酸,破坏模板作用,核酸链断裂,影响基因调控和表达功能,抗肿瘤药物的母体,癌变的预警标示物,第一节 化学物质的致突变作用,一切生物的变异和进化都可以认为是由于,DNA,结构的改变而引起蛋白质组成和性质变化的结果,郝璐璐 整容前,郝璐璐 整容后,呵呵，奇怪，这一株,水稻结出的稻谷好大,拿它作种子明年肯定,大丰收,!,大量的事实告诉我们，生物是能够发生变异的。这些变异有的能够遗传给后代，有的却不能！,变异的概念：生物的后代出现与亲本不同的性状（也包括后代个体间的差异）,可遗传的变异,不遗传的变异,一、基因突变的类型,基因突变,：,由,DNA,碱基顺序的改变引起生物遗传性状显著变化的现象，是基因的核苷酸顺序或数目发生改变。,单个碱基改变,点突变（,point mutation,）,多个碱基改变,缺失、重复和插入,基因突变的类型,碱基置换,移码,大段损伤,（,1,）碱基置换,（,substitution,）,它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。,分类,：,转换,（,transition,），,即,DNA,链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；,颠换（,transversion,），,即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。,对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是,直接,还是,间接,地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。,直接引起置换的,诱变剂,定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。,种类：很多。例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，,N-,甲基,-N,硝基,-N-,亚硝基胍,，,N-,甲基,-N-,亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。,作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起,DNA,复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。,羟胺只引起,GCA:T,，,其余都是可使,GC=A:T,发生互变的。,能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有（参见下表）。,若干诱变剂的作用机制及诱变功能,诱变因素,在,DNA,上的初级效应,遗传效应,碱基类似物,掺入作用,AT=GC,双向转换,羟 胺,与胞嘧啶起反应,GC,AT,的转换,亚硝酸,A,、,G,、,C,的氧化脱氨作用,交,联,AT=GC,双向转换,缺失,烷化剂,烷化碱基（主要是,G,）,烷化磷酸基团,丧失烷化的嘌呤,糖,-,磷酸骨架的断裂,AT=GC,双向转换,AT,TA,的颠换,GC,CG,的颠换,巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）,吖啶类,碱基之间的相互作用（双链变形）,码组移动（或）,紫外线,形成嘧啶的水合物,形成嘧啶的二聚体,交 联,GC,AT,转换,码组移动（或）,电离辐射,碱基的羟基化核降解,DNA,降解,糖,-,磷酸骨架的断裂,丧失嘌呤,AT=GC,双向转换,码组移动（或）,巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）,加热,C,脱氨基,CG,TA,转换,Mu,噬菌体,结合到一个基因中间,码组移动,亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。,HNO,2,胞嘧啶（,C,）,尿嘧啶（,U,）,HNO,2,腺嘌呤（,A,）,次黄嘌呤（,H,）,HNO,2,鸟嘌呤（,G）,黄嘌呤（,X,）,这些反应及形成物均可在,DNA,复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。,碱基转换的分子机制,以亚硝酸为例,亚硝酸引起,的,AT-GC,转换细节,这类诱变剂主要是一些,碱基类似物,如：,5-,溴尿嘧啶,(5-BU),和,5-,氨基尿嘧啶（,5,AU,）、,叠氮胸腺嘧啶（,AIT,）,等,等,；,作用方式,：,通过活细胞的代谢活动参入到,DNA,分子中，主要是在,DNA,复制时碱基类似物插入,DNA,中，,引起碱基对配对错误，造成碱基置换。,以,5-,溴尿嘧啶,(5-BU),为例：,5-BU,是,胸腺嘧啶（,T,）的,的,类似物,，酮式的,5-BU,可以和,A,配对，,烯醇式的,5-BU,可以和,G,配对，在,DNA,分子复制的过程中，由于,5-BU,的,插入和互变异构导致碱基置换。,间接引起置换的诱变剂,5-BU,引起的转换,5-BU,引起的转换,从上图中，还可以看到,5-BU,的掺入引起的,GC,回复到,A,T,的过程。通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。,也可以知道，为什么像,5-BU,这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的,DNA,分子却不起作用。,（,2,）移码突变,frame-shift mutation,或,phase-shift mutation,，,指诱变剂使,DNA,分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。,由移码突变所产生的突变株，称为,移码突变株,（,frame-shift mutant,）。,与染色体畸变相比，移码突变也只能算是,DNA,分子的微小损伤。,丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和,-,氨基丫啶等，以及一系列称为,ICR,类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂。,图,能诱发移码突变的几种代表性化合物,引起移码突变的诱变剂：主要是,吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等等。,这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤,嘧啶对十分相似。,吖啶类化合物的诱变机制：,至今还不很清楚。,有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个,嘌呤,嘧啶,对,十分相似，故能,嵌入,两个相邻,DNA,碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距,0.34nm,，,当嵌入一个丫啶分子时，就变成,0.68nm,），,从而在,DNA,复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。,吖啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：,基因突变的特点,普遍性,随机性,稀有性,有害性,不定向性,二、实例,镰刀型细胞贫血症,正常人的,红细胞,镰刀型贫血症患者的红细胞,讨论：镰刀型细胞贫血症的发病原因是什么？,临床表现,血红蛋白,6(N,端,),mRNA,基因,(DNA,上,),正常表现,正常,谷氨酸,CTT,GAA,GAA,镰刀型贫血,异常,缬氨酸,C,A,T,G,T,A,G,U,A,基因突变的实例,镰刀型细胞贫血症,基因突变的实例：,正常绵羊有时生下短腿“安康羊”,红花,蓝紫色,物理因素：主要是各种射线。如：紫外线、射线、,射线、,射线等。,化学因素：主要是各种能与,DNA,发生化学反应的化学物质。如烟碱、秋水仙素、黄曲霉毒素、硫酸二乙酯等。,生物因素：主要是某些寄生在细胞内的病毒。,三、基因突变的原因,1.,人工诱变的方法：,用射线（如紫外线、,X,射线、激光等）照射或致突变物质处理生物的敏感部位（植物的萌发种子、动物的生殖腺等）。,例：我国科技人员用,60,C,O,产生的射线照射水稻萌发的种子，培育出优质高产、抗病虫害强的新品种。,四、基因突变的应用,例：,1945,年爱尔兰科学家费来明发,现,青霉素以来，世界各地科学家用紫外线照射的方法处理青霉，将青霉素的产量提高了几千倍，价格下降到原来的几万分之一。,紫外线照,射处理,例：,1987,年，我国科学家将普通青椒种子搭载在人造卫星上使之接受宇宙射线照射发生基因突变，培育出产量特高，质量特别好的,“,太空椒,”,。,2.,人工诱变的优点：,优点：,大幅度提高变异频率，使变异性状较快稳定，缩短育种周期。,自然突变由于变异频率很低，产生的极少量变异个体混杂于大量未变异个体中，难以被发现并选出来进行培育。而人工诱变可以产生大量的变异个体，容易发现发生有利变异的个体并将其从中选择出来。如我国近年每年都有许多优质高产的农作物新品种出现，其中大多数都经过了人工诱变处理。,优点：,可以大幅度改良某些经济性状。,如青霉素的生产，从,1945,年到,1965,年,20,年时间就将单位产量提高了几十万倍。,优点：,可以产生原来没有的新品种甚至新种。,3.,人工诱变的缺点：,缺点：,变异的个体是杂合体,，并且常常是一个个体中既发生了有利变异又发生了不利变异，必须通过杂交方法将有利变异组合到同一个体中来。,缺点：,基因突变是不定向的,，生物发生的变异绝大多数是不利变异，因此,必须处理大量材料,形成大量变异个体再从中选择发生有利变异的个体。,缺点：,诱变的各种因素是致癌因素,，如有泄漏将造成人体伤害或环境污染。,灯笼形，特大果,平均单果重,250,克左右，,最大果可达,720,克,露地栽培,亩产,5000,公斤左右,大棚栽培,产量可达,8000,公斤,五、化学致癌物质以其作用机制,直接致癌物,直接作用于,RNA,、,DNA,、蛋白质等,烷化剂、亚硝胺物质,间接致癌物,需经代谢活化才与大分子化合物结合,多环芳烃类、亚硝胺类、芳香胺,促癌物,本身不致癌，但与致癌物同时作用时，能明显地强化致癌,巴豆油、丙酮、酚、氧化铁粉尘,有机致癌物,多环芳烃类、芳香胺类、,偶氮类、烷化剂类、,亚硝胺类及亚硝酰胺类、,内酯类、性激素、霉菌素,多环芳烃、亚硝胺及霉菌毒素是环境中三类最普遍最重要的致癌物,第二节 小分子药物与,DNA,的相互作用,一、共价结合,1,氮丙啶类抗生素,丝裂霉素,C,2,氨茴霉素、茅屋霉素等抗生素,3,螺旋丙烷类抗生素,二、非共价结合,大多数抗癌药物与,DNA,的作用都是非共价结合,典型沟区结合的药物分子,典型沟区结合的药物分子,嵌插结合,（,1,）经典的嵌插结合,药物分子通过嵌入,DNA,令,DNA,构象发生改变，使其不能或不易复制，而显现出抗肿瘤、抗病毒的活性。,（,2,）双嵌插,将两个嵌插环通过不同长度的链共价连接起来,（,3,）带有多个大取代基的嵌插剂,三、剪切作用,第三节,小分子化合物与,RNA,的相互作用,RNA,可成为新型小分子药物的作用靶点,一、,RNA,药靶的优越性,1,RNA,种类多样性,2,RNA,结构的多样性,在,RNA,分子中，并不遵守,DNA,中碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。,RNA,分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。,RNA,还可以形成更复杂的三级结构。,尽管转录于同一,DNA,，翻译相同的蛋白质，不同的转录子形式有不同的序列和独特的,RNA,三级结构形状。,二、作用于,RNA,的小分子药物,两大类：,一类是传染性疾病,新型抗菌和抗病毒药物研制；,另一类是非传染性疾病,包括抗癌和抗炎症药物研制。,1,与,HIV TAR RNA,作用的小分子化合物,反式激活（,TAR,）,反式激活依赖于,Tat,蛋白和一个,RNA,序列特异区（,TAR RNA,）的相互结合。,HIV 1,基因表达是由一类病毒编码的蛋白调控的，其中包括一种转录的反式激活子,T,at,。当基因表达的,T,at,水平增高时，病毒的复制才能够进行。这是通过,RNA,聚合酶,转录复合物延长的增加而达到的，也叫做反式激活（,TAR,）。,（,a,）新霉素,B,；（,b,）,2,4-,氨基喹唑啉；（,c,）喹唑啉,-2,3-,二酮；（,d,）吖啶衍生物,CGP40336A,2,与,rRNA,作用的小分子化合物,核糖霉素、巴龙霉素和利维霉素可与原核,rRNA,的,A,位点亚结构域形成特定的复合物；而安普霉素对原核亚结构域的强结合依赖于,1408,位点,RNA,具有高亲和性和特异性的靶点，小分子化合物可以作为基因研究的工具,第四节,核酸的小分子探针,一、分光光度法,1,测糖法,（,1,）二苯胺法,在强酸性条件下，水解后的,DNA,能与二苯胺反应，并有蓝色产物生成，其最大吸收波长位于,600mn,处，由此可以测得样品中核酸的含量，测定,DNA,的范围为,25250g/ml,。,优点,：与,UV,法相比，该方法更准确，灵敏度更高，,并且可以测定混合物。,缺点,：方法冗长（需,1620h,），条件苛刻，,在测定过程中容易造成样品的损失。,在硫酸中水解,DNA,，加入高碘酸和硫代巴比妥酸，则有粉红色反应物生成，,max,位于,532nm,处，可用于,DNA,的测定。,（,2,）硫代巴比妥酸,优点,：,RNA,和蛋白质不干扰测定,RNA,经热酸水解和转化之后，与地衣酚（,5-,甲基,-1,3-,苯二酚）在浓,HCL,及,Cu,2,或,FeCl,3,存在下反应，溶液呈绿色，,max,位于,670nm,处。在一定范围内，吸收强度与,RNA,的浓度成正比，用于测定,RNA,及其衍生物，灵敏度为,0.015mol/L,。,（,3,）地衣酚法,（,4,）定磷法,将核酸和核苷酸用强酸消化，使有机磷变成磷酸根，再用一般测定磷的试剂显色。根据磷的含量即可推算出核酸和核苷酸的含量,优点,：反应灵敏,缺点,：,DNA,和,RNA,都含有磷，测定时必须分别测定,2,染料结合法,基于多核苷酸中两个单核苷酸残基之间的电离具有较低的,p,K,值（,p,K,=1.5,），当溶液的,pH,高于,4,时，全部解离，呈多阴离子状态，具有与某些阳离子染料结合的能力。,优点：简便、快速、灵敏、准确,缺点：蛋白质对体系的测定干扰严重,（,1,）甲基绿,在,pH 7.9,的,Tris-HCl,缓冲溶液中，将甲基绿与核酸的混合液加热至,45,，,3h,之后，在最大吸收峰,630nm,处溶液的吸光度，吸光度的强度与一定浓度的核酸成正比，将该方法用以测定,DNA,，其测定范围为,0300g,，检出限为,2g,。,2,染料结合法,（,2,）甲苯胺蓝,甲苯胺蓝的水溶液在,628nm,处有一最大吸收峰，当有痕量,DNA,存在时，会导致最大吸收峰降低，吸收峰的降低程度与一定浓度的,DNA,成正比。,测定微克级的,DNA,，线性范围,04.0g/ml,，检出限,0.048g/ml,目前测定痕量,DNA,的较好方法,（,3,）乙基紫,pH6.47.4,时，乙基紫的,max,位于,595nm,处，当加入,DNA,后，乙基紫的吸收峰显著下降，而在,507nm,处出现新的吸收峰。,可用于,DNA,定量测定。线性范围为,1.0810-5mol/L,。,方法操作简便，灵敏度高，选择性较好，且反应迅速（,2min,后即可测定）,二、荧光法,（,1,）,3,5-,二氨基苯甲酸,（,2,）溴乙啶（,Ethidum,bromide,EB,）,（,3,）,DAPI,（,4,6-,二脒基,-2-,苯基吲哚）,（,4,）,meso,-,四（对,-,三甲基氨基）卟啉（,TAPP,）,（,5,）耐尔蓝（,Nile blue,NB,）又名尼罗蓝,（,6,）吖啶橙（,Acridine,orange,AO,）,三、共振瑞利散射法,对核酸等生物大分子的测定和表征是一种非常有用的技术，可用于核酸的定量测定。,（,1,）,TAPP,及质子化,TAPP,在,432nm,附近产生特征吸收峰。用于测定,ctDNA,，其线性范围为（,1.810.8,）,10-7mol/L,，检出限为,4.110-8mol/L,。,（,2,）亚甲蓝（,Methylene,blue,MB,）,用于痕量核酸的定量测定，其线性范围为,014g/ml,（,ctDNA,）和,00.24g/ml,（,yRNA,），检出限为,11.0ng/ml,（,ctDNA,）和,8.6ng/ml(yRNA),。,（,3,）中性红（,Neutral red,NR,）,在,pH,为,2.3,的,NR,溶液中，加入核酸后能导致溶液的,RRS,强度急剧增强，最大,RRS,峰位于,330nm,处，用于测定,ctDNA,，其线性范围为,0.0485.25g/ml,，检出限为,48.2ng/ml,。,（,4,）耐尔蓝（,Nile blue,NB,）,在弱碱性（,pH7.207.80,）的,Tris,缓冲介质中，耐尔蓝硫酸盐（,NBS,）能在核酸表面进行长距组装，并于,293.8nm,处产生特征的共振光散射峰。据此可用于,01.00g/ml,ctDNA,的测定。方法具有很高的灵敏度，检出限可达,0.7ng/ml,。,其他：罗丹明,B,、噻二嗪、香豆素、荧光素等,Thanks,