WS∕T 493-2017 酶学参考实验室参考方法测定不确定度评定指南.pdf
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1、书 书 书犐 犆犛 犆 中华人民共和国卫生行业标准犠犛犜 酶学参考实验室参考方法测量不确定度评定指南犌狌 犻 犱 犲狋 狅狋 犺 犲犲 狊 狋 犻 犿犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狋 犺 犲犿犲 犪 狊 狌 狉 犲犿犲 狀 狋狌 狀 犮 犲 狉 狋 犪 犻 狀 狋 狔狅 犳狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲犿犲 狋 犺 狅 犱 狊犻 狀犲 狀 狕 狔犿狅 犾 狅 犵 狔狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲犾 犪 犫 狅 狉 犪 狋 狅 狉 犻 犲 狊 发布 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布书 书 书目次前言范围规范性引用文件术语和定义缩略语测量不确定度 误差和不确定度 不确定度的来源
2、不确定度的分类评定测量不确定度 评定测量不确定度的一般步骤 评定测量不确定度的过程评定测量不确定度的具体步骤 规定被测量 参考方法测量酶催化活性浓度的测量程序和测量模型 识别所有可能测量不确定度来源 绘制测量过程因果(鱼骨)图和测量全过程不确定度计算公式 列出每一输入量的量值 计算每一输入量的标准不确定度和绘制预估表 计算酶催化活性浓度量值( ) 评定测量全过程的合成标准不确定度 计算扩展不确定度(犝)并确定合成因子(犽)和单位 输入量对测量不确定度的贡献图和主要输入量 不确定度的报告 总则 所需要的信息 报告标准不确定度 报告扩展不确定度 与限值的符合性 附录(资料性附录)寻找测量不确定度的
3、来源以及因果(鱼骨)图的绘制 附录(资料性附录)不确定度的常见来源和数值 附录(资料性附录)数据分布函数 犠犛犜 前言本标准按照 给出的规则起草。本标准起草单位:北京医院、北京航天总医院、江苏省南通医学院第一附属医院、广东省中医院、上海市临床检验中心、中国医学科学院北京协和医院、北京世纪坛医院。本标准主要起草人:杨振华、陈宝荣、王惠民、黄宪章、汪静、居漪、邱玲、张曼。犠犛犜 酶学参考实验室参考方法测量不确定度评定指南范围本标准规定了酶学参考实验室在运行参考方法时测量不确定度的来源、评定测量不确定度步骤及报告方式。本标准适用于酶学参考实验室评定参考方法测量酶催化活性浓度的测量不确定度,也适用于采
4、用分光光度原理测量的其他参考方法测量量值的测量不确定度评定,同时可供认可评审员在评审过程中使用。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 通用计量术语及定义 测量不确定度评定与表示 : 化学分析中不确定度的评定指南术语和定义 界定的以及以下术语和定义适用于本文件。 样本狊 犪犿狆 犾 犲从某系统中抽取的一个部件或较多部件,对其分析后可获取该系统的信息,通常为系统属性判定和系统形成提供参考。示例:来源于较大量血清的一定量的血清。示例:一组测量结果的一个无偏移或者随机选
5、择的亚组。 确认狏 犪 犾 犻 犱 犪 狋 犻 狅 狀通过检查和提供客观证据,表明能够满足预期应用的特定要求的验证。示例:通常用于测量水中氮浓度的测量程序,同样被确认为可测量人血清中氮浓度。注:预期应用或用户需要是在测量系统以外并与其无关;但是工作性能是测量系统或测量程序的一部分,也就是它在测量系统之内(验证) 。 验证狏 犲 狉 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀通过检查和提供客观证据表明某一规定项目能够满足特定要求。示例:证明达到测量系统的工作性能或法规要求。注:规定项目可以是过程、测量程序、物质、化合物或测量系统。注:特定要求可以是达到厂家的技术性能。注:化学中,所涉及实体的本质或者活性
6、的验证,要求描述该实体或活性的结构或特性。犠犛犜 缩略语下列缩略语适用于本文件。:变异系数( ) :国际临床化学和检验医学联合会( ):室内质控( ):国际理论和应用化学联盟( ):标准(偏)差( ):标准操作程序( )测量不确定度 误差和不确定度 误差是单个数值,原则上已知误差的数值可以用来修正结果。不确定度是以一个区间的形式表示,为一个分析过程和所规定样品类型做评估时,可适用于其所描述的所有测量值。对大多数医学实验室的检测项目而言,测量不确定度大小与测量值高低相关,一般不能用不确定度数值修正测量结果。此外,误差和不确定度的差别还表现在:修正后的分析结果可能非常接近于被测量的数值,因此误差可
7、以忽略。不确定度可能很大,因为分析人员对于测量结果的接近程度没有把握。测量结果的不确定度不可以解释为代表了误差本身或经修正后的残余误差。注:误差是一个理想的概念,不可能被确切地知道。 通常认为误差含有两个分量,分别称为随机分量和系统分量,包括以下内容: 随机误差通常产生于影响量的不可预测的变化。这些随机效应使得被测量的重复观察的结果产生变化。分析结果的随机误差不可消除,但是通常可以通过增加观察次数加以减少;注:算术平均值或一系列观察值的平均值的实验标准差是由一些随机效应产生的平均值不确定度的度量,而不是平均值的随机误差。由这些随机效应产生的平均值的随机误差的准确值是不可知的。 系统误差定义为在
8、对于同一被测量的大量分析过程中保持不变或以可以预测的方式变化的误差分量。它是独立于测量次数的,因此不能在相同的测量条件下通过增加分析次数的办法使之减小。包括:恒定的系统误差:例如定量分析中没有考虑到试剂空白,或多点设备校准中的不准确性,在给定的测量值水平上可能是恒定的,但是也可能随着不同测量值的水平而发生变化;不恒定的系统误差:在一系列分析中,影响因素在量上发生了系统的变化,例如由于试验条件控制得不充分会产生不恒定的系统误差。示例:在进行化学分析时,一组样品的温度在逐渐升高,可能会导致结果的渐变。示例:在整个试验的过程中,传感器和探针可能存在老化影响,可能引入不恒定的系统误差。 误差的另一个形
9、式是假误差或过错误差。这种类型的误差使测量无效,它通常由人为失误或仪器失效产生。记录数据时数字进位、光谱仪流通池中存在的气泡或试样之间偶然的交叉污染等是这类误差的常见原因。包括以下内容: 假误差并不总是很明显。当重复测量的次数足够多时,通常应采用异常值检验的方法检查这组数据中是否存在可疑的数据。所有异常值检验中的阳性结果都应该小心对待,可能时应向实验者核实。通常情况下,不能仅根据统计结果就剔除某一数值。犠犛犜 过错误差的测量不确定度是不可接受的,不可将此类误差计算到测量不确定度中。然而,因数字进位产生的误差可进行修正,特别是当这种误差发生在首位数字时。 测量结果的所有已识别的显著的系统影响都应
10、修正。测量仪器和系统通常需要用测量标准或标准物质进行调节或校准,以修正系统影响。与这些测量标准或标准物质有关的不确定度及修正过程中存在的不确定度应加以考虑。 用本文件获得的不确定度并没有考虑出现假误差或过错误差的可能性。 不确定度的来源 通常来源在实际工作中,结果的不确定度可能有很多来源,例如定义不完整、取样、基体效应和干扰、环境条件、质量和容量仪器的不确定度、参考值、测量方法和程序中的估计和假定、随机变化等。 酶学参考实验室不确定度主要来源 测量前阶段 抽样和样本准备酶学参考实验室主要工作是给委托的样本赋值,一般不存在取样问题。但如还接受评定样本间变异、样本稳定性等工作时,此时内部或外部取样
11、是规定程序的组成部分,例如不同样品间的随机变化以及取样程序存在的潜在偏差等影响因素构成了影响最终结果的不确定度分量。本文件对此暂不加以讨论。液体样本,常需深低温(如 )保存,测量前需加以融冻。应严格控制融冻条件,如规定放置在 水浴。此外在融化后应加以混匀,要严格控制混匀方式、时间和强度等,以控制不确定度来源。冻干粉末样本测量前需加蒸馏水复溶。应严格控制所加蒸馏水质量,应为实验室一级用水。有可能时应用称重法控制加水的量并规定复溶后混匀方法。通过这些措施减小样本准备时产生的测量不确定度。 存储条件若测试样品在分析前要储存一段时间,则存储条件可能影响结果。因此,存储时间以及存储条件也被认为是不确定度
12、来源。酶学参考实验室应注意某些酶是冷变性而非热变性。如低温保存样本,会加速乳酸脱氢酶变性,从而产生不确定度。 仪器的影响下列仪器会影响酶催化活性浓度的测量结果,包括: 分光光度计:主要不确定度来源有波长准确度、半波宽、读数的正确性、噪音和漂移等; 移液器:最大允许误差()和重复性; 天平:最大允许误差等。酶学参考实验室应使用最高级?的分析仪器,使用前应检查仪器性能,确保性能在规定的参数内。可按厂家声称的参数评定不确定度。犠犛犜 试剂配制酶反应试剂时有多种不确定度来源,即使配制试剂的原材料已被检测过,因为检测过程存在着某些不确定度,如某些情况下不能知道滴定溶液浓度。许多有机指示剂,纯度并不是 ,
13、可能含有异构体和无机盐。对于这类物质的纯度,制造商通常只标明不低于规定值。关于纯度水平的假设将会引进一个不确定度分量。反应混合液中各种成分浓度变化有可能是测量不确定度的来源:酶促反应速度受各种物质浓度的影响,有底物、激活剂、抑制剂、缓冲物等。当使用酶偶联反应测量酶活性浓度时,需使用各种工具酶(指示酶、辅助酶)和相应底物。参考方法已对试剂中各种物质做了最适浓度的研究和规定。在配制试剂时,只要正确地应用高级?天平称量,浓度变化很小,常可忽略不计,不计算它们的标准不确定度。但注意在称量量很小时,如和测量试剂中的磷酸吡哆醛、测量试剂中,最好通过实验验证这些物质由于称量误差能否引起较大的测量不确定度。试
14、剂的老化和不同批号配制也会引起测量不确定度,如在每个批次测量前重新配制试剂,则测量结果包含了配制试剂引起的不确定度并除去了试剂老化的影响。微量的杂质有可能抑制或激活酶的催化活性,这可能是产生测量不确定度一个很重要的来源。有必要对配制酶测量试剂的原材料制定更严格的要求,如 丙氨酸中 丙氨酸含量,双甘肽中甘氨酸含量等。 测量原理 假设的化学反应定量关系当假定分析过程按照特定的化学反应定量关系进行时,可能有必要考虑偏离所预期的化学反应定量关系,或反应的不完全或副反应。 测量阶段 测量时环境条件容量玻璃仪器一般在与校准温度不同的环境温度下使用。总的温度影响应加以修正,但是液体和玻璃温度的不确定度应加以
15、考虑。同样,当材料对湿度的可能变化敏感时,湿度也是重要的,此时湿度影响也应加以修正。 样品的影响复杂基体的被分析物的回收率或仪器的响应可能受基体成份的影响。被分析物的物种会使这一影响变得更复杂。由于改变的热力情况或光分解影响,样品(被分析物)的稳定性在分析过程中可能会发生变化。当用“加料样品”来估计回收率时,样品中的被分析物的回收率可能与加料样品的回收率不同,因而引进了需要加以考虑的不确定度。 空白修正空白修正的值和适宜性都会有不确定度,在痕量分析中尤为重要。 其他重要不确定度来源 最终反应混合液的狆犎酶催化反应速度受变化影响,一般而言,每个酶都有其最适反应,并随变化反应速度上升或下降。评定测
16、量不确定度时应考虑此分量。不同酶对反应不一致。在评定测量不确定度时往犠犛犜 往要计算灵敏系数。配制同一的缓冲液常可使用多种化学物质,应选择合适的原料。此时不仅要考虑原料的值,以保证有足够的缓冲能力,还要考虑原料本身是否具有抑制或激活酶催化活性的作用。 酶催化反应时的温度温度对酶催化活性浓度有明显的影响,一般而言,温度升高会加速反应,但超过一定温度后,由于酶蛋白变性而反应速度变慢。在评定测量不确定度时往往要计算温度影响的灵敏系数。 测量后阶段在计算酶活性浓度时需使用摩尔消光系数,应考虑此系数的不确定度。有些仪器选用直线回归,按斜率计算结果,有时会导致较差的拟合,因此引入较大的不确定度。修约能导致
17、最终结果的不准确,但这些是很少能预知的,所以建议不要在计算过程中,而在计算的最后进行修约,这样可能无必要考虑修约引起的不确定度。 其他 实验室条件的影响 温湿度:测量时实验室的温湿度通常对测量有一定的影响,尤其对酶学测量,不同温湿度条件对加样、分光光度计的散热、天平称量等多个与测量有关的环节影响量不同,通常也可产生一定的测量不确定度,但目前尚未找到有效的评定方法,应尽量保持测量时实验室温湿度一致是有效控制测量不确定度的方法。 磁场、噪声与振动:由于酶学项目通常采用分光光度计测量,强磁场、噪声与振动会干扰温度、吸光度等基于电子信号模式和工作原理的测量,测量区域应远离强磁场、噪声与振动区。 操作人
18、员的影响不论在何阶段,操作人员有很大影响,有可能是测量不确定度的重要来源。为查出和减小此分量的测量不确定度,应对操作人员进行严格培训、考核。不同批次测量由不同技术人员进行。 随机影响在所有测量中都有随机影响产生的不确定度。在评定测量不确定度时,该项应作为一个不确定度来源包括在列表中。 不确定度的分类 当用标准偏差表示时,测量不确定度分量称为标准测量不确定度。如果各分量间存在相关性,应考虑协方差。可以评价几个分量的综合效应,这可以减少评估不确定度的总工作量。如果上述综合考虑的几个不确定度分量存在相关,只需在综合时考虑采用协方差,在最后合成时,无需另外考虑其相关性。 对于测量结果狔,其不确定度称为
19、合成标准测量不确定度,记做狌() ,是一个标准偏差估计值,它等于运用不确定度传播律将所有测量不确定度分量(无论是如何评价的)合成为总体方差的正平方根。 在报告测量结果时,往往要用到扩展测量不确定度犝,扩展不确定度是指被测量的值以一个较高的置信水平存在的区间宽度。犝由合成标准不确定度狌()乘以包含因子犽得到。选择包含因子犽犠犛犜 时应根据所需要的置信水平,对于大约 的置信水平而言,犽值为。报告扩展不确定度时应注明包含因子犽,因为只有如此才能复原被测量值的合成标准不确定度,以备在可能需要用该量进行其他测量结果的合成不确定度计算时使用。评定测量不确定度 评定测量不确定度的一般步骤 第一步:规定被测量
20、清楚地说明需要测量什么,包括被测量和被测量所依赖的输入量(例如被测数量、常数、校准标准值等)的关系。并以标准操作程序()或其他方法描述中给出测量有关的技术资料。 第二步:识别不确定度的来源(参见附录犃)列出不确定度的可能来源。包括在第一步中所规定的测量模型关系式中所含参数的不确定度来源,但也要考虑可能还有其他的来源。应包括那些由化学假设所产生的不确定度来源。 第三步:不确定度分量的量化(参见附录犃)绘制因果(鱼骨)图和不确定度计算公式;对第二步识别和列出的每一个不确定度来源列出量值并计算相关的不确定度分量大小。通常可能评估或确定与大量独立来源有关的不确定度的单个分量。还有一点很重要的是要考虑所
21、列出的数据是否反映所有的不确定度来源。常需计划其他的实验和研究来保证不确定度来源都得到了充分的考虑。 第四步:计算合成不确定度和扩展不确定度在第三步中得到的信息,只是不确定度的一些量化分量,它们可能与单个来源有关,也可能与几个不确定度来源的合成影响有关。这些分量应以标准偏差的形式表示,并根据不确定度传播律有关规则进行合成,以得到合成标准不确定度,并应选择适当的包含因子来给出扩展不确定度。 评定测量不确定度的过程评定测量不确定度的过程见图。犠犛犜 图评定测量不确定度的过程评定测量不确定度的具体步骤 规定被测量 规定酶活性浓度测量的被测量按照 规定的格式,医学实验室中被测量的名称为“系统组分;量的
22、种类” 。犠犛犜 示例:血浆(血液) 钠离子;对特定的人在特定时间内的物质的量浓度等于 。规定被测量的要素包括:含被测量组分的系统,如人血清、全血、血浆、脑脊液等;被测量组分,如丙氨酸氨基转氨酶() ;被测量的量,如物质量浓度、物质量活性、数量浓度。按模式“系统(说明) 组分(说明) ;量(说明)”给出被测量诸要素,见表。表酶催化活性浓度测量中被测量的诸要素序号被测量单位测量程序系统组分量 参考方法( ) 定义不确定度表可清楚说明有明确结构的小分子,如钠和尿素等一类的被测量,但是对酶类大分子被测量,上述说明常不完整。在确定酶的被测量往往出现“定义不确定度” 。将术语“定义不确定度”叙述为“由于
23、被测量定义中细节量有限所引起的测量不确定度分量” ,所以在文件中,在评定被测量的测量不确定度时,不是首先列出测量模型,进行具体计算,而是要求应第一步明确被测量,找出由于被测量定义中细节量有限而引起的不确定度分量。在确定酶类被测量时,定义不确定度还可能有以下来源: 被测量的组分结构不一,大多数酶存在多种同工酶,有些同工酶还可进一步分为若干亚型。不同同工酶、亚型最适反应条件常有区?。所用参考方法选用条件不当,有可能引起测量结果变化。示例:目前 推荐的碱性磷酸酶()参考方法选用的缓冲液,不同同工酶反应不一,有可能引起不同样本测量结果的不一致。比较而言日本参考方法的缓冲液更适合各不同的同工酶组分。同一
24、样本用此两种参考方法测活性,测量结果常出现较大差异。 测量原理不完善。当假定分析过程按照特定的化学反应定量关系进行的,可能有必要考虑偏离所预期的化学反应定量关系,或反应的不完全或副反应。在某些酶学测量中由于上述原因可引起结果的不可靠。示例:测量转氨酶的酶偶联试剂还同时测谷氨酸脱氢酶活性。示例:用单一试剂测转氨酶,会由于过量丙酮酸引起假性转氨酶升高。 样本受系统中其他因素影响,主要有溶血、黄疸和乳糜血。示例:血清中由于红细胞溶解,红细胞中酶进入血清,引起假性升高或下降。示例:脂血症或?疸血使空白吸光度读数升高,有可能干扰结果。 由 ( )制备的(有证参考物质)中,各种酶来源于非人源组织,与常规酶
25、学测量的样本(人血清)缺乏良好的互换性,如直接应用校准常规酶学测量方法则存在明显的基质效应。 治疗和(或)诊断药物干扰。不少药物是酶的抑制剂或激活剂,有可能干扰酶活性浓度的测量,不同酶产生定义不确定度的原因不一样,可分?在表的“符号”栏中划“”注明,同时用文字说明。示例:使用巴比妥药物治疗 综合征时,可引起谷氨酰转肽酶()活性升高,停药后恢复正常。犠犛犜 表引起定义不确定度的各种因素符号定义不确定度来源说明被测量结构不一致测量原理不完善溶血、黄疸、脂血干扰基体效应药物干扰(可单独列为一项)其他 犐 犉犆犆参考方法测量酶催化活性浓度的测量程序和测量模型 测量程序 测量前阶段 样本准备根据样本来源
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