微生物遗传育种-基因重组与育种.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 基因重组与育种,引言,基因重组（,Gene recombination）：,凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传个体的方式，称遗传重组（,Genetic recombination）。,重组与突变的不同点：,突变是指一个细胞的同一个基因组中某一点或某一,DNA,片段发生的变异；而重组是来自两个细胞的不同基因组间遗传物质交换的结果，重组可在微生物细胞不发生突变的情况下形成新的基因型与表型。,杂交（,Hybridization）:,是指不同基因型的亲本个体或细胞（指单细胞生物）交配而产生子代的过程。,重组是分子水平上的概念，而杂交是细胞水平上的概念。,杂交中必然含有重组，但重组则不限于杂交这一种形式。,第一节 细菌、放线菌的接合及育种,一、细菌的接合作用,接合（,Conjugation,）,：,指供体菌与受体菌的完整细胞经过直接接触而传递大段,DNA,（,包括质粒）遗传信息的现象。,（一）接合现象的发现,1946年，,J.Lederberg,和,E.L.Tatum,将来自,E.coli K12,的两种营养缺陷型菌株混合培养，其遗传标记如图。结果在单独培养的平板上无菌落，而在混合培养的平板上长出了原养型菌落。,2、互养的排除,营养缺陷型细菌通过培养基交换养料而产生的现象称为互养。,Lederberg,和,Tatum,将培养过一种营养缺陷型细菌的培养基经过灭菌、过滤，然后加入到另一营养缺陷型菌培养物中。即使前一种菌在培养、灭菌、过滤之前曾发生过裂解，也不能是后一种菌产生原养型。,3、回复突变的排除,若要发生两种突变的回复突变，其几率为10,12,，,这是不可能的。,4、异核体和杂合二倍体的排除,A,B,A,B,A,B,A,B,A,B,异核体,杂合二倍体,单倍重组体,异核体和杂合二倍体的遗传性状不稳定，在传代过程中会发生性状分离，但事实恰恰相反，原养型菌落的基因型是稳定的，证明是单倍重组体。,（三,）,接合的机制,1、接合作用中两菌株性别的存在,Lederberg,和,Tatum,认为在两个细菌的亲本细胞在接合过程中起同等作用即,E.coli,的性系统被认为是同宗配合。,1952年，,W.Hayes,利用,Lederberg,和,Tatum,所做的杂交实验，对（,A）Met,Bio,（Sm,s,或,Sm,r,）（B）Thr,Leu,B1,（Sm,r,或,Sm,s,）,进行研究。结果表明，在杂交期间，两品系所起的作用是不同的，是一种单向异宗配合过程，两品系在获得的同时发生了性别的变化。其中，供体品系相当于雄性，而受体品系相当于雌性。,2、,F,因子的存在,（1）,E.coli,的某些种（如品系,A）,记为,F,，,带有一个性因子，或致育因子,F（fertility factor），,而另一个不育型品系记作,F,，,记不带有性因子；,（2）杂交,F,F,是可育的，杂交,F,F,是不育的；,（3）,F,因子可以传递，从,F,到,F,细菌，但必须通过细胞接触；,（4）,F,因子能够自发丧失，一旦丧失就不再恢复，除非通过另一个,F,细胞在传递过来。,F,细胞经低浓度的吖啶橙处理后丧失,F,因子，也会偶尔自发地或经紫外线处理丧失。,3、,F,因子及,F,细胞的特性,F,是一种可遗传性状，能够自我复制，类似于染色体基因，但不是染色体基因，其转移的频率可高达70以上。,F,因子是独立于染色体外的小型环状,DNA,分子，具有自体复制及转移到其他细胞中去的能力。,大小约是细菌基因组,DNA,的2，分子量为6.3,10,6,d、94.5kb。,整个基因组编码94个蛋白质，其中13的基因与接合作用有关。,F,因子基因组有三个主要的基因丛，分别负责插入、复制和转移的功能。,A.,转移区（,Transfer-region）：,是一个操纵子，由22个基因组成，33,kb，,位于,F,因子结构图的6093,kb,之间。其中，,tra J、A、L、E、N、B、W、V、C、U、F、H,这些基因与性菌毛的合成与装配有关；,tra Y、Z、M、I、G、D,等基因产物与,DNA,的转移有关；,traG,和,traN,的基因产物与细菌结合有关；,traS,和,traT,的基因产物与表面排斥有关。,B.,复制区（,replication-region）：,位于,F,因子结构图谱的4049,kb，,包含一个特异的,复制蛋白基因,frp,（F replication proteins）、,决定不相容性基因,inc,（incompatibility）,和一个,复制起始点,oriV,（vegetative origin of replication）。,C.,插入区（,insertion region）：,位于,F,因子结构图谱的9317.6,kb，,包含四个插入序列，,IS,3,有直接重复的两个，另外两个是,IS,2,和,，,它们主要与,F,因子的整合、切除、易位有关。,F,因子的主要表现型是,细胞表面有性菌毛,，即,F,细胞表面都有性菌毛。,F,性菌毛分布在大肠杆菌的表面，数目与,F,因子相当，长度为120,um。,性菌毛的功能：,A.,是两性细胞接合时转移,DNA,的通道，又叫性纤毛桥（,sex pili bridge）；B.,又是特异,phage,吸附的部位。,4、接合时,DNA,转移的机制,接合时,DNA,转移的机制目前不详，但可以确定的是：,在接合时，性菌毛的存在是必需的。,（四,）F,因子的三种存在形式,1、,F,：F,因子在细胞中以游离状态存在。,2、,Hfr（high frequency of recombination）:F,因子在细胞中以整合状态存在。,Hfr,与,F,的异同：,（1）,F,与,Hfr,均能与,F,菌株杂交；,（2）,F,与,Hfr,均能合成细胞表面附属物性菌毛；,（3）,Hfr,菌株总是从,F,菌株中得到，而,F,却从未在,Hfr,菌株中得到过；,（4）,Hfr,经吖啶橙处理后性质不变，而,F,经吖啶橙处理后失去,F,因子；,（5）,Hfr,与,F,杂交后，,F,性质一般不会变；而,F,与,F,杂交后，,F,变为,F,。,3、F：,携带有部分核染色体基因的,F,因子，含有,F,因子的菌株称为,F,菌株。,（五,）,三种“雄性”菌株与,F,接合后的结果,1、,F,F,2F,由性菌毛将不同接合型的的细菌连在一起，并且在细胞间形成胞质桥（也称接合管）。在形成接合对以后，,F,菌的,F,因子进行,DNA,滚环复制。单链转入,F,菌，并合成新的互补链。,2、,Hfr,F,HfrF,Hfr,的染色体双链中的一条链在,F,因子处发生断裂，由环状变为线状，,F,因子则位于线状单链,DNA,的末端，整段线状染色体（单链）也以5,末端引导，等速地转移至,F,细胞。,通过接合而获得新性状的受体细胞称为接合子。（,conjugant）,3、,F,F,2F,Hfr,菌株的,F,因子的反常切除所形成的,F,因子有两种类型：,I,型：包含了染色体一个区域和不完全的,F,因子。,II,型：带有完整的,F,因子,DNA,和位于,F,因子插入两端的染色体基因。,F,菌的共同特征,（1）,I,型,F,一般携带的基因是,Hfr,上的末端，这部分基因在,Hfr,F,时是低频转移的，而在,F ,F,时却是高频转移的。,（2）,II,型,F,菌使本来转移频率差异悬殊的两部分基因具有相同的频率。,（3）,F,菌的最大特点是能构建稳定的部分二倍体。,F,因子转导,：通过,F,因子的转移而使受体菌改变,它的遗传性状的现象称为,F,因子转导或,或性因子转导或简称性导（,F duction,或,sex duction）,拟表型菌,：指表型上属于,F,而遗传性上仍是,F,的菌，也就是说表面没有性菌毛，因而,丧失了表面排斥性。,（六,）,中断杂交实验,原理：,如果人为地中断正在基因转移的杂交对，然后测定受体菌里遗传标记重组频率，就能知道基因连锁情况。,1957年，,E.L.Wollman,和,F.Jocob,设计了中断杂交实验。,供体菌,Hfr，,受体菌,F,thr,leu,lac,gal,azi,r,ton,r,str,r,，,将大约10倍的,F,菌和,Hfr,对数期菌混合，轻轻振荡培养，在不同时间间隔取样，在组织搅拌器中剧烈振荡后，将培养物经适当稀释后，涂布在含链霉素且以葡萄糖作为碳源的基本培养基上进行选择。,中断杂交实验,中断杂交实验的结果：,基因是以,ori、thr、leu、azi、ton、lac、gal,的顺序连续转移的。在这个实验中，对,Hfr,菌的条件是，,str,基因在整个待测顺序的后端，如果,str,s,基因率先进入受体，获得的重组体将在第一次选择性培养基上被,str,杀死。另外，,thr、leu,选择性标记应位于前端，如位于后端则无法测序。,二、放线菌的接合作用,（一）放线菌基因重组的发现,1955年，,Sermonti,夫妇在天兰色链霉菌（,streptomyces coelicoler,）ISS,株中首次发现通过遗传性交换而产生的重组，接着，,Hopwood,也用,S.coelicoler,A,3(2),发现了同样的重组。,（二）放线菌的性别,1、三种性别,原始致育型（,IF，initial fertility）：,相当于,E.coli,的,F,正常致育型（,NF，normal fertility）：,相当于,E.coli,的,Hfr,超致育型（,UF，ultra fertility）：,相当于,E.coli,的,F,2、认为,IF,相当于,E.coli,的,F,、UF,相当于,E.coli,的,F,的理由,（1）,IF,以0.3的频率转变为,UF，,在经,uv,处理的,IF,群体中曾经得到作为受体高度可育的,UF,菌株，这种情况类似于从,F,菌株中得到,F,菌株；,（2）,IFUF,杂交中，,UF,受体菌株全部转变为,IF，,而染色体基因重组频率大约为10,4,，两者相差万倍。这种情况与,F,F,相似。,3、认为,NF,相当于,Hfr,的理由,（1）,IF,和,NF,都产生对于,UF,菌株具有抑制作用的次甲霉素，而,UF,菌株则不产生这一抗菌素；,（2）,IF UF,杂交子代全部都是,IF，,这种转变和染色体基因转移无关，但是,NF UF,杂交则不同，,UF,转变为,NF,都伴随着染色体重组；,（3）,NF,菌株来自,IF,或是,IF,的杂交子代，与,E.coli,中的一样。,（三）放线菌的致育因子,经研究发现在,S.coelicoler,中存在着一种称为,Scp,1,的致育因子。,Scp,1,和,F,因子一样也是一种质粒，具有转移性，在自身转移的同时还能够带动染色体进行转移。此外,Scp,1,还带有与产生次甲霉素有关的基因，,Scp,1,属于附加体质粒。,（四）天兰色链霉菌三种致育类型与大肠杆菌的三种致育类型之间的区别,1、大肠杆菌中,F,F,是不育的，但在天兰色链霉菌中,UF,UF,是可育的，只是频率较低，说明还有另外一种致育因子的存在；,2、大肠杆菌中,F,F,或,Hfr Hfr,杂交的可育性很低，除非使其中一个成为,F,的拟表型，但在天兰色链霉菌中,NF NF,和,IF IF,杂交中一部分是高度可育的；,3、大肠杆菌中,F,F,的子代都是,F,而,Hfr,F,的子代都是,F,，,但在天兰色链霉菌中,IF UF,的子代是,IF，NF UF,的子代也是,NF。,三、采用接合技术育种,Hfr,细菌和,F,细菌接触带来两个细菌细胞的接合和染色体从,Hfr,细菌向,F,细菌转移。因此，接合杂交是确定特定基因的粗略位置的有效方法，也是育种的一种手段。,一般采用液体接合培养法，在接合时注意通气和选择标记。选择性标记可以用抗性标记，也可以用营养缺陷型。,第二节 转化与育种,转化（,transformation）,：,受体细胞直接吸收来自供体细胞的离体,DNA,片段，并通过交换把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细胞的某些遗传性状的现象。获得新性状的受体称为转化子（,transformant）。,转化不是两个细胞的直接接触，而是供体细胞的离体,DNA,与受体细胞直接接触而转移遗传物质。,一、转化过程,转化包括两个基本过程,（1）从供体菌中提取遗传物质,DNA,并转移到受体中；,（2）供体的遗传物质在受体中的作用。,（一）转化,DNA,的特点,1、转化子的数目与,DNA,浓度的关系,在一定条件下转化子的数目与转化,DNA,的浓度成正比。,细菌生长量,每毫升中转化子数,10,4,10,5,10,3,10,2,10,2,20 40 60 80 100 120,10,100,培养时间,每毫升中转化子数,10,3,10,2,10,1,DNA,转化的饱和浓度,2、,DNA,片段的大小与转化子数目的关系,对于转化作用来说，转化,DNA,片段必须具有一定的大小。一般认为，转化,DNA,片段的大小没有上限，但是在制备转化子过程中，往往人工打断供体,DNA,分子，获得的片段约10,7,dal（,大约10个基因左右）。在受体细胞摄取,DNA,时，可能还会进一步断裂，所以仅仅有大约0.5的供体基因组能够进入受体细胞。,能发生转化作用的核苷酸链至少不低于450,bp。,3、单双链,DNA,与转化活性的关系,单链,DNA,的转化活性低，而双链,DNA,的转化活性高。因而，,DNA,完整的双链结构对于转化活性来说是必要的。,4、转化,DNA,的命运,大量的实验证明，在转化作用中遗传重组是由供体的单链序列取代了受体,DNA,的单链序列，使受体的,DNA,标记变成了供体的遗传标记，并恒定表达，遗传给它的后代。,（二）受体细胞的特点,1、受体细胞的感受态,（1）概念,只有在某一特定条件下培养的部分细胞才有吸收,DNA,的能力，这种细胞称为感受态细胞。这种感受态细胞所处的状态称为感受态（,competence）。,（2）感受态的特点和影响因素,特点：感受态不是一种透性特征，而是在适当的生长条件下获得的一种生理特征,影响因素：,受菌龄的影响：一般认为感受态出现在细菌生长对数期的后期；,受遗传因素的影响；,受环境条件的影响。,2、感受态的比例,不同的细菌的感受态的比例是不同的，一般为1020。,3、感受态可在细胞间转移,4、感受态因子（,CF）,1963年，,R.Pakula,和,W.Walczak,首次从链球菌中分离得到；1972年，,Leonard,和,Cale,纯化的一种蛋白质，称为,CF。,该蛋白质在感受态转移中起作用。,在感受态细胞表面存在着一种特定的抗原，而非感受态细胞则没有这种抗原。细菌细胞在特定的时期产生一种感受态因子（,CF），CF,与膜上的受体结合，刺激核内,DNA,产生另一个蛋白自溶素（,Autolysin），,自溶素转运至细胞膜和细胞壁之间的周质内作用于细胞膜，并改变膜的成分，使细胞膜便于,DNA,的吸收。,二、转化过程的基因重组及育种,（一）转化技术用于基因定位,在转化过程中，两个连锁的基因可以同时转化，但能够同时转化的基因却不一定是连锁的，因为包含这两个基因的,DNA,片段可以同时被受体细菌所吸收。,如果,a,+,和,b,+,是连锁的，那么当,DNA,浓度下降时，,a,+,b,+,转化频率的下降与,a,+,或,b,+,的转化频率下降相同；相反，如果,a,+,和,b,+,并不连锁，那么,a,+,b,+,转化频率下降将远远超过,a,+,或,b,+,的转化频率。这是因为在,DNA,低浓度范围内，转化子的产生与,DNA,的浓度成正比。当,a,+,、,b,+,两个基因位于同一,DNA,片段上是，,a,+,b,+,转化子与,DNA,浓度成正比的增加；当,a,+,b,+,基因分别位于不同的,DNA,片段上是，在一定的,DNA,浓度内，,a,+,b,+,转化子与,DNA,浓度的平方成正比。通过这样的实验检测转化基因的连锁情况可以方便的绘制出遗传图谱。,以,trp,+,和,tyr,+,DNA,作为供体,q,trp,+,tyr,trp,tyr,+,trp,+,tyr,trp,+,tyr,+,trp,tyr,+,共转指数：,如将,DNA,加入到受体菌中，会产生、和三种转化子，将型转化子在其中所占的比例称为共转指数（,cotransfer index）,共转指数,a,+,b,+,a,+,b,+,a,b,+,a,+,b,（二,）,转化育种,利用在转化过程中供体菌可将遗传性状传递给受体菌的这种特性，育种工作者可以采用转化的方法达到育种的目的。,第三节 转导与育种,一、转导的概念,通过完全缺陷或部分缺陷的噬菌体为媒介，把供体细胞的,DNA,片段携带到受体细胞中，通过交换和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导（,transduction）。,获得新性状的受体细胞就称为转导子（,transductant）。,转导有两种类型，即普遍转导和局限转导。,二、转导现象的发现及证明,1952年，,N.Zinder,和,Lederberg,在研究鼠伤寒沙门氏菌遗传重组时，采用两种营养缺陷型菌：,LA2:,phe,+,trp,+,met,his,LA22:,phe,trp,met,+,his,+,在将两者混合培养后获得了原养型。同时，再将两者放入,Davis,管中培养时仍出现重组体，这就证明在两株菌之间有一种过滤性因子起作用。,过滤性因子是噬菌体（,phage）,的证明：,过滤性因子不会因,DNase,处理而失去活性，说明它不是裸露在溶液中的,DNA，,故可以排除转化作用，另外由于两个菌是隔离培养的因而也可以排除接合作用；,过滤性因子与从溶源性菌分离到的噬菌体,P,22,具有相同大小的质量；,用抗,P,22,的血清或加热处理，使,P,22,的感染性和过滤性因子的功能失活的速率相同；,抗,P,22,的沙门氏菌菌株同时也对过滤性因子表现为抗性。,因此可以证明：过滤性因子就是温和型噬菌体,P,22,。,三、普遍性转导（,generalized transduction,）,通过完全缺陷的,phage,对供体菌任何,DNA,小片段的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。,（一,）,完全普遍转导,噬菌体在进行包装时，有极少数,phage（10,6,10,8,）,的衣壳将与头部,DNA,相仿的一小段供体,DNA,片段误包在内，形成完全不含,phage,自身,DNA,的假噬菌体，这种假噬菌体称为完全缺陷噬菌体。,由完全缺陷噬菌体介导的普遍性转导称为完全普遍转导。,（二,）,流产普遍转导,简称流产转导（,abortive transduction）。,经转导而获得了供体菌,DNA,片段的受体菌，如果其外源,DNA,在体内既不进行交换、整合、复制，也不迅速消失，而进行转录、转译及性状表达，这种现象称为流产转导。,流产转导的受体菌可以在选择性培养基上形成微小的菌落。,四、局限性转导（,specialized transduction,）,指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。,特点：1、只能是个别特定基因；,2、该特定基因由部分缺陷噬菌体携带；,3、缺陷噬菌体是由于在其形成过程中所发生,的低频率“误切”或由于双重溶源菌的裂解而形,成。,局限转导,（一,）,低频转导（,LFT，low frequency transduction,）,由于宿主染色体上进行不正常的切离的频率极低，因此在裂解物中所含的部分缺陷,phage,的比例也极低。这种裂解物称为,LFT,裂解物。,LFT,裂解物在低,m.o.i.,情况下感染宿主，可获得极少量的局限转导，这就是低频转导。,m.o.i.：,称作感染复数，是指每一个敏感细胞所能吸附的相应,phage,的数量。,（二,）,高频转导（,HFT，high frequency transduction,）,双重溶源菌：,在高,m.o.i.,情况下，受体菌会同时吸附缺陷型,phage,和完整,phage，,并且可以同时整合在受体菌的核染色体组上，这时的受体菌称为双重溶源菌。此时，正常的,phage,称为助体,phage。,由双重溶源菌形成的裂解物称为,HFT,裂解物。,高频转导：,用低,m.o.i.,的,HFT,裂解物去感染受体细胞，则可高频率的发生局限转导，这就是高频转导。,五、转导用于基因定位,普遍性转导噬菌体通常可以用于绘制供体菌遗传图谱。,应用于基因定位的共转导现象：,P1,噬菌体的基因组约为染色体长度的,2.4,，,P1,噬菌体感染,E.coli,后可以随意包裹寄主,DNA,片段，只要这个片段包含的基因座位不超过,E.coli,遗传图谱的两分钟距离，均可一起被转导，这是一般用接合和转化作用来进行基因定位所难以实现的，对细菌染色体小片段的精细结构十分有用。,两个邻近的基因一起被转导的现象称为,共转导（,co,transduction),。,当转导的,DNA,片段进入受体后，与受体同源分子进行重组，当另一个基因的标记被选择时，那么另一个邻近基因的发现频率随着它们二者之间距离的减少而增大，这个频率称为,共转导频率（,cotransduction frequency,）。,用下式表示：,F,（,1,d,L,）,3,d,为两个基因之间的距离，,L,是,P1,基因组或转导片段长度（在遗传图谱上用分钟表示）。,比如：有两个基因的共转导频率是,65,，,L,为,2,分钟（约,76kb,）。,这两个基因之间的距离为,0.26,分钟（约,10kb,）。,六、转导育种,利用转导法选育目的菌，首要的任务是要,获得转导噬菌体,。,转导噬菌体的获得：,噬菌体侵染供体菌后，在感染末期，少数噬菌体会将供体菌的,DNA,误认为是它们自己的,DNA,，并以其外壳蛋白将细菌,DNA,包围起来，从而形成转导噬菌体。,由于细菌,DNA,的任何部分都可以被包装，因此，要获得目的转导子必须要通过那些选择性标记。,转导育种的过程,操作过程如下：,先将供体菌培养至对数生长期，然后向其中加入噬菌体，继续培养是一部分供体菌发生裂解反应而释放出转导噬菌体。加入氯仿以杀死仍活着的供体菌，待完全溶菌后低速离心以除去菌体残渣，上清液经,Dnase,处理和微孔滤膜除菌后，即制成供体菌裂解液。,将受体菌培养至对数生长期，向其中加入供体菌裂解液，待转导噬菌体吸附后，低速离心收集菌体。将该菌体转移到选择培养基平板上，培养即可从中获得目的转导子。,首先要进行噬菌体效价的测定。所谓噬菌体效价就是,1ml,培养液中含有活噬菌体的数目。,第四节 微生物原生质体融合和育种,一、原生质体融合的概念,所谓,原生质体融合,，就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之成为原生质体。然后在高渗的条件下混合，并加入物理的、化学的、生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集。通过细胞质融合、核融合，而后发生基因组间的交换、重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程。,狭义的原生质体（,protoplast,）即细胞壁被彻底酶解完全,脱壁后形成的,1,、原生质体,广义的原生质体既包括狭义的原生质体也包括不完全脱,壁后形成的圆球体（,spheroplast,）,物理的：瞬时高压的交变电场或激光等,2,、助融条件,化学的：聚乙二醇、二甲亚砜、伴刀豆球蛋白,A,、磷,脂酰丝氨酸、溶血卵磷脂等,生物的：仙台病毒、鸡新城疫病毒、等,关于原生质体概念的解释：,二、原生质体融合在生物工程中的地位,生物工程,（,biotechnology,）,细胞工程,基因工程,酶工程,发酵工程,固定化细胞,基因体外重组,染色体移植或引入,细胞器移植,核移植,固定化酶,酶分子的改造和修饰,发酵自动化,产品后处理,泛指遗传工程,组织培养,原生质体融合,1,、原生质体融合是一种更为广泛，更为随机的基因重组方式；,2,、原生质体融合方式，可以打破微生物的种属界限，实现远缘菌株间的基因重组；,3,、原生质体融合可以使遗传物质传递更为完全，可以获得更多基因重组的机会，有利于提高育种速度；,4,、借助融合剂可同时将几个亲本的原生质体随即融合在一起，从而获得综合几个亲本性状的重组体，加速育种进程；,5,、原生质体融合可以和其它育种方法相结合，把从其它方法得到的优良性状通过原生质体融合在组合到一个单株中，提高菌株产量的几率增大；,三、原生质体融合及原生质体技术的理论与实践意义,6,、原生质体融合可以大大提高遗传重组的频率；,7,、在生产菌种的选育中，可以应用具有较高产量性状的菌株作为融合时出发菌株，以期达到理想育种的目的；,8,、可以应用灭活的原生质体进行融合，从而提高筛选效率，省去育种过程中对亲株的遗传标记，省去人力、物力和时间，也可防止因增加标记而降低出发菌株的产量；,9,、原生质体技术有助于建立工业微生物的转化体系，开辟新的育种途径；,10,、对微生物制备原生质体后直接再生育种、原生质体诱变后再生育种、原生质体转化育种、原生质体转导育种、原生质体固定化等原生质体技术在微生物育种与工业生产中近年来已日趋广泛开展；,11,、在理论上，微生物的原生质体融合可用于研究噬菌体与寄主间的关系，深入了解溶源机理及免疫因子和存在部位；研究原噬菌体的,DNA,在寄主染色体上的结合位点；,12,、在细胞学研究方面，通过原生质体融合，有助于研究核质关系及细胞质遗传问题；,13,、微生物原生质体融合，可用于遗传性分析等理论研究。,（,1,）标记菌株的筛选；,（,2,）原生质体的制备；,（,3,）原生质体的再生；,（,4,）原生质体的融合；,（,5,）融合子的选择；,（,6,）实用型菌株的筛选。,四、原生质体融合育种的基本程序,原生质体融合一般包括如下步骤：,B,A,A,B,a,+,b,-,a,-,b,+,菌株标记,细胞壁,溶菌酶,A,B,细胞膜,加,PEG,混合,融合的原生质体,转再生平皿,2,B,A,1,3,4,筛选融合子,温浴,稳定高产重组子,标记的,营养体细胞,原生质体,1,a,+,b,-,2,a,+,b,+,3,a,-,b,-,4,a,-,b,+,原生质体的形成,融合,CW,再生,稳定,正变株的筛选,细胞原生质体融合程序示意图,（一）标记菌株的筛选,在原生质体融合过程中，为了便于筛选，通常对于所用的,亲株,都要进行一定的遗传标记。,一般可以采用,营养缺陷标记,和,抗药性标记,。,（二）原生质体的制备,在细菌和放线菌中主要采用溶菌酶,；,在酵母菌和霉菌中一般可用蜗牛酶和纤维素酶。,影响原生质体制备的因素,1、菌体的预处理,为了使酶的作用效果更好一些，可对菌体进行预处理，包括菌体培养阶段的预处理和酶解前的预处理。,对于细菌可加入甘氨酸、青霉素和,D,环丝氨酸等，对于放线菌可以使用甘氨酸（,1,4,）等，在酵母菌中加入,EDTA,和巯基乙醇等。,2,、菌体的培养时间,为了使菌体易于原生质体化，一般选择对数生长期的菌体。,一般对于细菌采用对数生长期后期为好，对于放线菌采用对数生长期与稳定期之间的转换期最为合适。,3,、酶浓度,一般来讲，酶浓度增加，原生质体形成率增加，但是超过一定范围，则原生质体形成率增加的效果不明显；酶浓度过低，则导致原生质体再生率下降。,通常，采用当原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度作为最佳酶浓度。,4,、酶解温度,温度对酶解作用有双重影响。一方面，随着温度的提高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度的增加，酶蛋白逐渐变性而失活。因此，最适温度是这两方面的共同结果。,一般在选择最佳温度时，除了考虑酶的最适温度外，还要以原生质体再生率加以校正。,5,、酶解时间,原生质体的制备质量与酶解时间有密切的关系。酶解时间过短，原生质体形成不完全，结果会影响到融合；酶解时间过长，原生质体脱壁太完全，原生质体的质膜也会受到损伤，从而会影响到再生，最终也不利于融合。,因此，选择一个最适的酶解时间对于原生质体融合是非常重要的。,6,、原生质体制备液（渗透压稳定剂）,高渗透压,在原生质体制备中不仅起到保护原生质体免于膨胀作用，而且有助于酶与底物的结合。,渗透压稳定剂的选择：,细菌蔗糖、丁二酸钠、,NaCl,等,酵母菌山梨醇、甘露醇等,霉菌,KCL,、,NaCl,等,渗透压稳定剂的浓度一般采用,0.3,0.8,mol/L,。,原生质体形成率,破壁前菌数剩余菌数,破壁前菌数,100,原生质体形成率的计算,（三）原生质体的再生,一般在进行原生质体再生时，采用含有渗透压稳定剂的培养基进行培养。渗透压稳定剂的选择同制备时是一样的。,原生质体的再生是一个复杂的过程，其影响因素有很多，包括菌体本身的再生特性、原生质体制备的条件、再生培养基的成分、再生培养条件等等。,原生质体再生率的计算,原生质体再生率,再生菌数剩余菌数,破壁前菌数剩余菌数,100%,再生菌数总菌数,（,1,制备率）,总菌数,制备率,100%,（四）原生质体的融合,在进行原生质体融合是通常要加入聚合剂聚乙二醇（,PEG,）。,PEG,的分子量采用,4000,6000,为好；融合时的终浓度一般为,30,40,；由于有,PEG,加入使得融合很有效地进行，同时,PEG,在高浓度下是有毒的，因此聚合时间不宜过长。,在融合时，一般也加入,Ca,2+,，浓度以,0.01mol,L,为好。,（五）融合子的选择,原生质体融合后有两种情况：,2,、暂时的融合，形成异核体。,1,、真正的融合，即产生杂合的二倍体或单倍重组体；,两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，而后一种则不稳定。要获得真正的融合子，必须在融合原生质体后，进行几代自然分离、选择，才能加以确定。,一般采用影印法。,（六）高产菌株的筛选,高产菌株的筛选需要在生产实践中进行选择。,例如：,通过北京棒杆菌,1134,衍生株（,Hser,，,Bio,，,Nal,+,，,AEC,r,，）和枯草芽孢杆菌,BR151,衍生株,（,Met,，,Trp,，,Rif,r,）之间的原生质体融合获得,了融合子,Q4413,（,Met,Trp,Hser,Bio,Rif,r,AEC,r,，,Nal,r,）,一、有性杂交（,Sexual Hybridization,）,有性杂交一般指性细胞间接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传性后代的一种育种技术。,从理论上讲，凡能产生有性孢子的酵母菌或霉菌都可应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。,第五节 真菌的有性杂交和准性杂交,杂交是细胞水平上发生的一种遗传重组方式。,项目,二倍体,单倍体,细胞,菌落,液体培养,在产子囊培养基上,大、椭圆形,大、形态均一,繁殖较快、细胞易分散,形成子囊,小、球形,小、形态变化较多,繁殖较慢、常聚集成团,不形成子囊,S.Cerevisiae,的二倍体和单倍体细胞比较,二、准性杂交（,Parasexual Hybridization,）,准性生殖（,Parasexual reproduction,或,Para,sexuality,）是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式，它可以使同种生物的两种不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式导致低频率的基因重组，并产生重组子。,准性生殖常见于某些真菌中，如半知菌。其过程如下：,1,、菌丝联结（,anastomosis,）；,2,、形成异核体（,heterocaryon,）；,3,、核融合（,nuclear fusion,）,;,4,、体细胞交换（,somatic crossing-over,）,项目,准性生殖,有性生殖,参与接合的亲本细胞,独立生活的异核体阶段,接合后二倍体的形态,双倍体变为单倍体的途径,接合发生的几率,形态相同的体细胞,有,与单倍体基本相同,有丝分裂,偶尔发生、几率低,形态或生理上有分化的性细胞,无,与单倍体明显不同,减数分裂,正常出现、几率高,准性生殖与有性生殖的比较,