微生物学第五章微生物营养与培养基.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 微生物营养,与培养基,营养,(nutrition),：生物体从外部环境中摄取对其生命活动必须的能量和物质，以满足正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。,营养物,(nutrient),：具有营养功能的物质。,营养物提供生命活动的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。,一些微生物可利用非物质形式的能源,光能。,一、细胞化学组成,整个生物界大体相同，主要是,C,、,H,、,O,、,N,（占干重,9097%,），,C,占约,50%,，此外为各种无机元素，由这些元素再组成化合物。其中,C/N,一般是,5:1,。,第一节,微生物的六种营养要素,元素,大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫,其他元素：钾、钠、钙、镁、铁、锰、铜、,钴、锌、钼等,存在方式,有机物：蛋白质、糖、,类,脂、核酸、维生素、降解产物、代谢中间产物,无机盐灰分,水,细胞湿重的,70%90%,元素,细菌,酵母菌,霉菌,碳,50,49.8,47.0,氮,15,7.5,5.2,氢,8,5.7,6.7,氧,20,31.1,40.2,磷,3,1.5,1.2,硫,1,0.3,0.2,微生物细胞中几种主要元素的相对含量（,%,干重）,一般生物能利用的，微生物能利用；,一般生物不能利用的，微生物也能利用；,对一般生物有害的，微生物还能利用,。,微生物是杂食性的：,异养微生物：必须利用有机碳源,自养微生物：能利用无机碳源,（一）碳源,(carbon source),提供微生物营养所需碳元素的营养源。,有机碳源：,蛋白质，核酸，,淀粉,，,葡萄糖等,无机碳源：,CO,2,Na,2,CO,3,CaCO,3,等,糖类：葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，淀粉，半乳糖，乳糖，甘露糖，纤维二糖，纤维素，半纤维素，甲壳素，木质素，等,有机酸：乳酸，柠檬酸，延胡索酸，低级脂肪酸，高级脂肪酸，氨基酸，等,醇类：乙醇，等,脂类：脂肪，磷脂，等,烃类：天然气，石油，石油馏分，石蜡油，等,CO,2,碳酸盐：NaHCO,3,CaCO,3,白垩，等,其他：芳香族化合物，氰化物，蛋白质，肽，核酸,微生物可利用的碳源(化合物分类),有机氮源：蛋白胨、黄豆粉、玉米浆,无机氮源：,NH,4,NO,3,、,(NH4),2,SO,4,气态氮源：大气,N,2,（二）氮源,(nitrogen source),凡能提供微生物营养所需氮元素的营养源。,氮源一般不作能源。,速效氮源,迟效氮源,能为微生物的生命活动提供最初能量来源的化学物质或辐射能。,（三）能源,(energy source),异养微生物的碳源同时也是能源,无机物：化能自养微生物的能源,能源谱,化学物质,辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源,有机物：化能异养微生物的能源,单功能：辐射能,双功能：还原态无机养料，如,NH,4,+,既是硝酸盐细菌的能 源，又是氮源,三功能：,N,C,H,O,类营养物质常是异养微生物的能 源，碳源兼氮源,一种营养物具有一种以上营养要素的功能,一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳源，氮源自行合成的、所需极微量的有机物。,培养基中生长因子来源：,酵母膏、玉米浆、麦芽汁等。,(,四)生长因子,(growth factor),作用：辅酶或酶活化,所需,。,狭义：维生素,广义：维生素、氨基酸、碱基、脂肪酸等,生长因子自养型微生物（,auxoautotrophs,),生长因子异养型微生物（,auxoheterotrophs,),营养缺陷型微生物（,nutritional deficiency),变株,生长因子过量合成型微生物,维生素,微生物的种,硫胺素(B,1,),Bacillus anthracis,(炭疽芽孢杆菌),核黄素,Clostridium tetani,(破伤风梭菌),烟酸,Brucella abortus,(流产布鲁氏杆菌),吡哆酸(B,6,),Lactobacillus spp.,(各种乳酸杆菌),生物素,Leuconostoc mesenteroides,(肠膜状明串珠菌),泛酸,Proteus morganii,(摩氏变形杆菌),叶酸,Leuconostoc dextranicum,(葡聚糖明串珠菌),钴胺酸(B,12,),Lactobacillus spp.,维生素K,Bacteroides melaninogenicus,(产黑素拟杆菌),若干细菌所需要的维生素,维生素,转移的对象,代谢功能,硫胺素(B,1,),乙醛基,焦磷酸硫胺素是脱羧酶、转醛酶、转酮酶的辅基，与,a,酮酸的氧化脱羧和酮基转移有关,吡哆醇(B,6,),氨基,磷酸吡哆醛是氨基酸消旋酶、转氨酶与脱羧酶的辅基，参与氨基酸的消旋、脱羧和转氨,叶酸,甲基,即辅酶F(四氢叶酸)，参与一碳基的转移，与合成嘌呤、嘧啶、核甘酸、丝氨酸和甲硫氨酸有关,维生素B,12,羧基，甲基,钴酰胺辅酶，参与一碳基的转移，与甲硫氨酸和胸苷酸有关,维生素的生理功能,（五）无机盐(inorganic salts),所需浓度在,10,-3,-10,-4,M,的元素为大量元素,所需浓度在,10,-6,-10,-8,M,的元素为微量元素,无机盐的生理功能,无机盐,大量元素,微量元素,一般功能,特殊功能,细胞内一般分子成分(P、S、Ca、Mg、Fe等),生理调节物质,渗透压的维持(Na,+,等),酶的激活剂(Mg等),pH的稳定,化能自养菌的能源(S,、,Fe,2+,、,NH,4,+,、,MO,2,-,等,),无氧呼吸时的氢受体(NO,3,-,、,SO,4,2-,等,),酶的激活剂(Cu,2+,、,Mn,2+,、,Zn,2+,等,),特殊分子结构成分(Co、Mo等),生理作用：,细胞组成成分,生化反应溶剂,化学、生理反应介质,物质运输媒体,调节细胞温度,维持细胞的渗透压,（六）水,存在状态：游离态（溶剂）和结合态（结构组成）,依碳源不同：,异养型,(,heterotrophs,):,不能以,CO,2,为主要或唯一碳源,自养型,(,autotrophs,):,能以,CO,2,为主要或唯一碳源,第二节 微生物营养类型,依能源不同：,光能营养型,(,phototrophs,):,光反应产能,化能营养型,(,chemotrophs,):,物质氧化产能,依生长因子的不同：,原养型,(prototroph),或野生型,(wild type),营养缺陷型,(auxotroph),微生物的营养类型,营养类型,能 源,碳源,实例,光能自养型,光能,CO,2,蓝细菌,紫硫细菌,绿硫细菌,藻类,光能异养型,光能,CO,2,及,简单有机物,红螺细菌,化能自养型,无机物,CO,2,硝化细菌,硫化细菌,铁细菌,氢细菌,化能异养型,有机物,有机物,绝大多数微生物，,原生动物,寄生型,(parasitism),寄生于活的生物体,腐生型,(,saprophytism,),寄生于死亡的生物有机体,化能异养型,营养类型划分不是绝对的，不同生活条件下，可相互转变。,异养微生物：至少需提供一种大量有机物才能满足其正常要求的微生物，即其碳源必须是有机物，氢供体是有机物，能源则可以利 用氧化有机物或吸收日光能而获得。,自养微生物：不依赖于任何有机营养,物,即可正常生活的微生物。,第,三,节 细胞对营养物质的吸收,离子化合物：弱快强慢（极性）,营养物质的吸收与代谢产物的分泌，涉及到物质的运输、营养物吸收至胞内被利用、代谢物分泌到胞外以免积累，这就是物质运输过程。,在营养物质运送方面，细胞壁仅简单地排阻分子量过大,(600Da),的溶质进入,而具有磷脂双分子层和嵌合蛋白分子的细胞膜则是控制营养物质进入和排除的主要屏障。,通透性与吸收是不同概念,一般大分子先水解为小分子，再吸收,脂溶性物质：易透过,一,、单纯扩散,(simple diffusion),依靠胞内外溶液浓度差，顺浓度梯度运输；,不消耗代谢能，无特异性；,运输氧、二氧化碳、甘油、乙醇、某些氨基酸等小分子；,亲脂性分子从高浓度到低浓度的扩散来运输，利用细胞膜的通透性，细胞膜是一道屏障。,二、促进扩散(facilitated diffusion),利用膜内、膜外被运输物质和载体蛋白的亲和力的不同。,特点：,需要特异性的载体蛋白顺浓度梯度运输,不消耗能量,运输硫酸根、磷酸根、糖（真核）,载体蛋白(carrier protein)，即透性酶（大多为诱导酶），有底物特异性，每种载体蛋白运输相应的物质。载体蛋白可加快运输速度，但不能逆浓度运输。,促进扩散示意图,胞外,细胞膜,胞内,单纯扩散,促进扩散,浓度梯度,运输速率,单纯扩散和促进扩散的比较,单纯扩散随浓度增加而线性增加，而促进扩散在一定浓度后出现平台,单纯扩散、促进扩散、主动运输,：,被运输的溶质分子不发生改变。,3,、主动运输,(active transport),特点：,是微生物吸收营养的主要方式,可逆浓度梯度运输，耗能,需载体蛋白，有特异性,运输,有机离子、无机离子、氨基酸、乳糖等糖类,需要特异性载体蛋白需要能量来改变载体蛋白的构象,亲和力改变蛋白构象改变耗能,细胞内,细胞外,(,或细菌周质空间,),电子转运,1.,电子转移能被用来将质子泵出膜外,2.,质子梯度通过反运输机制将钠离子逐,出膜外,3.,钠离子与载体蛋白复合物相结合,4.,溶质结合位点的形状发生改变，而与溶质,(,如糖和氨基酸,),结合,5.载体蛋白的构象发生改变，钠离子在膜内释放，随后溶质从载体蛋白解离,主动运输的机制：使用质子,(H,+,),和钠离子,(Na,+,),梯度。,特点：,属主动运输类型,溶质分子发生化学修饰,定向磷酸化,需复杂的运输酶系参与,运输葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等,4、基团转位(group translocation),膜对大多数磷酸化合物具有高度的不渗透性。,每输入一个葡萄糖分子，就要消耗一个ATP 的能量。,主要依赖磷酸烯醇式丙酮酸,(PEP),和磷酸转移酶系统,(PTS),。,PEP+HPr,EI,丙酮酸+P-HPr,P-HPr+糖,EII,糖-P+HPr,1.热稳定性载体蛋白,(heat stable carrier protein,HPr),的激活,2.,糖磷酸化后运入膜内,基团转位运输葡萄糖示意图,两类磷酸烯醇式丙酮酸：糖基磷酸转移酶(PTS)系统,高能磷酸从HPr转移至溶解态EIIA,EIIA与EIIB在甘露糖转运系统中相连，在葡萄糖转运系统中分开。无论那种形式，磷酸都从EIIA转移至EIIB，再经过穿膜的转运过程而转移至糖基。,磷酸烯醇式丙酮酸,(PEP),第一个酶,I(EI),低分子量热稳定性载体蛋白,(HPr),第二个酶,I(EII),胞质,细胞质基质,培养基(medium，culture medium)：是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。,第四节 培养基,（一）四个原则,1、目的明确（根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基）培养什么微生物、获得什么产物、用途,二、选择和配制培养基的原则和方法,2、营养协调营养协调(注意营养物的浓度和配比，特别是碳氮比C/N比),C/N,比,:,微生物培养基中所含的碳源中的碳原子与氮源中氮原子的摩尔数之比。不是简单的某碳源的重量与氮源的重量之比。因为，不同种类的碳源和氮源，其中含碳量和含氮量差别很大。,一般培养基的,C/N,比为,100/0.52,。,以含氮量来看：,NH,3,(82%)CO(NH,2,),2,(46%)NH,4,NO,3,(35%)(NH,4,),2,CO,3,(29.2%)(NH,4,),2,SO,4,(21%),适宜营养物质的选择,表3微生物常见的有机碳源,种类,举例,说明,单糖,葡萄糖，麦芽糖，果糖，麦芽糖，半乳糖，木糖,用作速效碳源，但会加速菌体呼吸，溶氧下降中间代谢物积累,二糖,蔗糖，乳糖,用作速效碳源，但会加速菌体呼吸，溶氧下降中间代谢物积累,多糖,淀粉，玉米粉，纤维素,迟效碳源。纤维素只有少数微生物能够作为碳源。,糖蜜,甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜,是非常好的碳源，成分复杂，在发酵工业中常用酵母发酵、抗生素和丙酮丁醇生产常用它为碳源。一般包括蔗糖35%，葡萄糖9%，果糖7%，8种其它糖类4%，其它还原物质3%，24种氨基酸占4.5%，有机酸5%，蜡质、甾醇和磷脂占0.4%，灰分12%，水20%。,麦芽,发芽的大麦,主要培养酵母用，工业上用麦芽汁发酵，制作啤酒。,油脂,棉籽油，玉米油，豆油，葵花籽油等。,热值高，液体培养时消耗氧气多。在工业上常常少量添加作为消泡剂使用。,醇类,甲醇，甘油,甲醇被用来培养酵母。,烃类,CH,4,，C,2,H,6,，C,4,H,10,，C12C20烷烃,热值高，液体培养时消耗氧气多。溶解性不好，液体培养对搅拌要求高。,有机酸,乙酸，乳酸，柠檬酸等,利用会导致pH上升,表 不同能源培养细胞的得率,碳源基质,葡萄糖（糖蜜）,甲烷,正烷烃,甲醇,乙醇,醋酸盐,顺丁烯二酸盐,细胞得率,（g细胞/g基质）,0.51,0.62,1.03,0.40,0.68,0.34,0.36,表 常见微生物氮源,种类,可以利用的微生物,特点,有机氮源：牛肉浸膏、酵母浸膏、花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、麦麸、尿素等,大部分微生物，如青霉，酵母，大肠杆菌。,含有丰富的氨基酸，是微生物的优良氮源。,无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等,部分微生物（氨基酸异养型不能利用）,硝酸盐要还原后才能用，可以同时调节pH。,N,2,少数细菌（约50多个属，100多种）,生物固氮是地球上仅次于光合作用的第二个重要的生物化学反应。,表 常用的培养基中的无机盐及参考浓度（g/L）,无机盐,提供的元素,参考浓度,培养基名称,MgSO,4,Mg,0.5,察氏培养基,KH,2,PO,4,/K,2,HPO,4,K，P,0.12/1.0,克氏培养基,KCl,K,0.5,察氏培养基,NaCl,Na,5,牛肉膏蛋白胨培养基,CuSO,4,5H,2,O,Cu,0.016,氧化硫酸杆菌培养液,ZnSO,4,7H,2,O,Zn,0.22,氧化硫酸杆菌培养液,FeSO,4,Fe,0.01,察氏培养基,CaCl,2,2H,2,O,Ca,0.25,氧化硫酸杆菌培养液,NaHCO,3,Na,0.1,蓝细菌培养基,MnCl,2,4H,2,O,Mn,0.05,氧化硫酸杆菌培养液,（NH,4,）,6,Mo,7,O,24,4H,2,O,Mo,0.01,氧化硫酸杆菌培养液,pH,渗透压和水活度,氧化还原电位,3、物理化学条件适宜:,细菌,:pH7.08.0,放线菌：,pH7.0 8.5,酵母菌,:pH3.86.0,霉菌：,pH4.06.0,pH：微生物有最佳生长pH,微生物在生长过程中培养基pH值可能发生的变化：,在含糖基质上生长,会产酸而使,pH,下降，,在分解蛋白质和氨基酸时,会产,NH,3,而使,pH,上升，,以,(NH,4,),2,SO,4,作,N,源,会过剩,SO,4,2-,而使,pH,下降，,分解利用阳离子化合物如：,NaNO,3,会过剩,Na+,而使,pH,上升。,维持培养基pH的方法,使用磷酸缓冲剂：,K,2,HPO,4,/Na,2,HPO,4,H,2,PO,4,/NaH,2,PO,4,采用“备用碱”：CaCO,3,、,CaHCO,3,采用弱酸盐：柠檬酸盐、乳酸盐等,采用液氨或盐酸,渗透压(osmotic pressure):高浓度溶液向低浓度溶液渗透时，其溶质分子所产生的压力。,高渗溶液会导致微生物细胞发生质壁分离,低渗溶液会导致微生物细胞吸水膨胀甚至破裂,水的可利用性,用水活度,(water activity,aw),表示,a,w,：在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水含量。,a,w,=P/P,o,P:溶液的蒸汽压 P,o,:纯水的蒸汽压,水活度需等渗适宜。微生物适宜生长的aw为0.60.998之间。,在常温常压下，纯水的aw为1.00,在同温同压，某溶液的饱和蒸汽压与纯水的饱和蒸汽压之比。,溶 液,a,w,30%葡萄糖溶液,0.964,1%葡萄糖+20%甘油,0.955,1%葡萄糖+40%蔗糖,0.964,饱和氯化钠溶液,0.78,饱和氯化钙溶液,0.30,饱和氯化镁溶液,0.30,饱和氨化锂溶液,0.11,几种溶液的水活度值,氧化还原电位,Eh,（,redox potential,）：氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子的趋势。,好氧微生物：,+0.1V,。,一般,+0.3+0.4V,厌氧微生物：,+0.1,以下,兼性微生物：,+0.1,以上好氧呼吸；,+0.1,以 下进行发酵,4、,原料来源的选择,经济节约原则,:,以粗代精、以废代好、以简代繁,原料来源要广泛,原料要易处理，处理成本要低,原料处理后，废物、废液、废气要少,灭菌处理,高压蒸汽灭菌：1.05kg/cm，121,0,C，1530min,高温灭菌对营养物质的破坏及pH变化,（二）四种方法,生态模拟,查阅文献,精心设计,实验比较,培养基类型,依对培养基成分的了解：,天然培养基,(complex medium,undefined medium),，,指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培,养基，成分未知。如培养细菌所用的肉汤蛋白胨培养,基，培养酵母菌的麦芽汁培养基等。,优点：,取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便,组合培养基,(defined medium),，,或称合成培养基,(synthetic medium),是一类用多种高纯化学试剂配制的、各成分（包含微量元素）的量都确切知道的培养基。如培养细菌所用的葡萄糖铵盐,培养基，培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基（高氏一号）。,较昂贵，一般用于研究工作（代谢、遗传分析）。,优点：组份精确、重复性好。,半合成培养基,(Semi-defined medium),固体培养基,(solid medium),，,一般加有凝固剂，凝固剂含量一般为,1,2,。,作为凝固剂的条件：不被微生物分解利用，生长温度范围内保持固体状态，凝固点温度对微生物无害，不因灭菌而破坏，透明度好、配制方便、价格低。常用的为,琼脂与明胶。,由于固体培养基能提供表面，形成单菌落，因此可用于：菌种分离、鉴定、保藏等。,液体培养基,(liquid medium),，,培养基中没有凝固剂。,用途：大量培养微生物，研究生理代谢等。,半固体培养基,(semi-solid medium),，,凝固剂含量一般约为,0.5%,用途：观察细菌的运动，测定噬菌体效价等。,按培养基外观的物理状态：固体、半固体、液体。,培养基固化物琼脂与明胶的比较,化学,成分,营养,价值,分解性,融化温度,凝固温度,常用,浓度,透明度,粘着力,耐加,压灭菌,琼脂,聚半乳糖的硫酸酯,无,罕见,96,0,C,40,0,C,1.52%,高,强,强,明胶,蛋白质,作氮源,极易,25,0,C,20,0,C,512%,高,强,弱,依功能不同：,选择培养基,(Selected medium),：,：,根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。,功能：混合菌中劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。,鉴别培养基,(Differential medium),：,加有能与某一菌的无色,代谢产物发生反应的指示剂，从而用肉眼就能使该菌落与,外形相似的其他菌落相区分的培养基。,用途：细菌学检验遗传研究，,EMB(Eosin Methylene Blue)培养基中培养大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H,+,故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，使菌落呈深紫色。从菌落表面反光还可看到绿色金属闪光。而产酸弱的菌株的菌落呈棕色。不发酵乳酸的菌落无色透明。,鉴别肠道细菌的伊红美蓝乳糖培养基,伊红美蓝(EMB,Eosin Methylene Blue),培养基,小 结,1、微生物需要大约10种大量元素，部分是用于构成碳水化合物、脂质、蛋白、核酸,几种其它元素，很少量地需要作为辅酶和辅基。,2、所有微生物根据它们对碳源、能量或氢原子或电子的要求都可以在营养上被归类。,3、营养分子不能通过被动扩散持续穿过细胞质膜，它们必须被三种主动运输机制中的一种进行运输。,培养基在实验室培养微生物是需要的，在微生物鉴定，水质鉴定，食品的分析中都需要分离特定的微生物，因此，为了不同的目的常需要不同的培养基。,本章复习思考题,1、,什么是大量元素、什么是微量元素。,2、,微生物需要的大量元素包括哪几种？,3、,什么叫营养？什么叫营养物？营养物有那些生理功能？,4、,试列表比较动物、植物、微生物对营养要素和营养方式的异同。,5、,什么叫碳源、列出微生物常用的碳源。,6、,微生物在碳源利用上有何不同？,7、,什么叫氮源？列出微生物常用的氮源。,8、,微生物利用氮源有何特点？,9、,什么叫氨基酸自养型？什么叫氨基酸异养型？,10、,比较营养物质进入细胞的差异？,11、,什么叫培养基？什么是天然培养基？,12,、什么是半固体培养基？,13、什么叫鉴别培养基，举一个鉴别培养基的例子和鉴别原理。,14、什么叫碳氮比？,15、配制备培养基的基本原则是什么？,参考文献:,1,沈萍微生物学北京：高等教育出版社，,2000,2,周德庆微生物教程第,2,版北京：高等教育出版社，,2002,3,黄秀梨,.,微生物学第,2,版,.,北京：高等教育出版社，,2001,4,诸葛健，李华钟,.,微生物学第一版北京：科学出版社，,2004.9,5 Prescott LM.,等著,.,微生物学第,5,版,沈萍等译，北京：科学出版社，,2000,6 Prescott LM,Harley JP,and Klein DA.Microbiology(5th ed.),Higher education press and McGraw-Hill Companies,Inc.2002,7 Michael TM,John MM,Jack P.Brock biology of micoorganisms,，,International edition,Pearson Education,Inc.2003,8 Gregory N.Stephanopoulos,Aristos 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