第05章核酸的化学.ppt

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T.Avery(1877-1955).,埃弗里，,美国细菌学家，他和,C.,麦克劳德、,M.,麦卡锡于,1944,年共同证明了遗传物质是,DNA,而不是蛋白质。,一、核酸的生物功能,（一）核酸是遗传变异的物质基础,核酸所含有的基因决定物质的遗传特性,;,变异使物种进化和生物发展成为可能。,基因：,系指含有合成一个功能性生物分子（蛋白质或,RNA,）所需信息的一个特定,DNA,片段。,（二）核酸与生物遗传信息的传递,核酸的遗传信息决定蛋白质的结构,（三）核酸与医药,致病：,DNA,分子结构的改变,抗病：核酸类似物,治疗：基因治疗,基因工程药物：生物药物的一种新生产手段,二、核酸的分子组成与,基本结构单位,单核苷酸,Mononucleotide,核酸的化学组成,1.元素组成,C、H、O、N、P（910%）,2.分子组成,碱基(,base)：,嘌呤碱，嘧啶碱,戊糖(,Five-carbon Sugars,),核糖(,ribose),脱氧核糖(,deoxyribose),磷酸(,phosphate),核酸,核苷酸,磷酸：,H,3,PO,4,核苷,戊糖,（核糖或脱氧核糖）,碱基,（,嘌呤或嘧啶,）,核酸分子的基本结构单位,核苷酸,嘧啶,嘌呤,1.,碱基(,Bases),（一）核苷和核苷酸,嘌呤：,purine,嘧啶：,pyrimidine,腺嘌呤（,A）,鸟嘌呤（,G）,胞嘧啶（,C）,尿嘧啶（,U）,胸腺嘧啶（,T）,adenine,guanine,cytosine,uracil,thymine,稀有碱基：,、,I、DHU、m,7,A、m,7,G、,I,I DHU m,7,G,R,2,1,3,4,5,6,2.,戊糖（,Five-carbon Sugars）,-D-,核糖,(,ribose),构成,RNA,-D-2-,脱氧核糖,（,deoxyribose）,构成,DNA,磷酸（,phosphate）：H,3,PO,4,两类核酸分子组成比较,DNA,A、G、C、,T,脱氧核糖（,dR,）,磷酸,RNA,A、G、C、,U,核糖（,R,）,磷酸,碱基 核糖 磷酸,3.,核苷(,ribonucleoside),的形成,碱基和核糖（脱氧核糖）通过,糖苷键,连接形成核苷（脱氧核苷）。,嘌呤核苷糖苷键：,N9C1,嘧啶核苷糖苷键：,N1C1,腺苷,脱氧胞苷,4.,核苷酸(,ribonucleotide),核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,碱基,五碳糖,磷酸,核,苷,酸,自然界存在的游离核苷酸为,5,核苷酸，,5,可略去。,碱基不同：,可产生由,A、G、C、U、T,组成的五,类核苷酸。,戊糖不同：,可产生由脱氧核糖和核糖组成的两类,核苷酸,DNA,和,RNA。,磷酸的数目不同：,可产生含1个、2个或3个磷酸,基的不同核苷酸,NMP、NDP、NTP。,O,N,N,NH2,O,OCH2,P,O,OH,HO,OH,H,1,1,脱氧胞苷酸（,dCMP）,参与构成,RNA,的碱基、核苷及相应的核苷酸,RNA,核苷,5-,核苷酸,碱基,base ribonucleoside ribonucleotide,腺嘌呤,adenine(A),腺苷,adenosine,腺苷酸（,AMP）,鸟嘌呤,guanine(G),鸟苷,guanosine,鸟苷酸（,GMP）,胞嘧啶,cytosine(C),胞苷,cytidine,胞苷酸（,CMP）,尿嘧啶,uracil(U),尿苷,uridine,尿苷酸（,UMP）,参与构成,DNA,的碱基、核苷及相应的核苷酸,DNA,脱氧核苷 5-脱氧核苷酸,碱基,base deoxyribonucleoside deoxyribonucleotide,腺嘌呤,adenine(A),脱氧腺苷,deoxy,adenosine,脱氧腺苷酸(,d,AMP),鸟嘌呤,guanine(G),脱氧鸟苷,deoxy,guanosine,脱氧鸟苷酸(,d,GMP),胞嘧啶,cytosine(C),脱氧胞苷,deoxy,cytidine,脱氧胞苷酸(,d,CMP),胸腺嘧啶,thymine(T),脱氧胸苷,deoxy,thymidine,脱氧胸苷酸(,d,TMP),体内重要的游离核苷酸及其衍生物,含核苷酸的生物活性物质：,NAD,+,、NADP,+,、CoA-SH、FAD,等都含有,AMP,多磷酸核苷酸：,NMP，NDP,，,NTP,环化核苷酸,:,cAMP，cGMP,AMP,ADP,ATP,cAMP,NADP,+,NAD,+,三、核酸的分子结构,Molecular structure of nucleic acid,（一）,DNA,的分子结构,1.DNA,的一级结构,定义,核酸中核苷酸的排列顺序。,由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为,碱基序列,。,3,5 磷酸二酯键,概念：一个核苷酸戊糖,C3,的游离羟基与另一个核苷酸戊糖,C5,上的磷酸脱水缩合生成的化学键。,NH2,O,N,N,O,OCH2,P,O,OH,HO,H,O,N,N,NH2,O,OCH2,P,O,OH,OH,H,O,3,5,5,端,3,端,C,G,A,交替的,磷酸,基团,和戊糖,构成了,DNA,的骨架,(backbone),。,DNA,链的方向是,5,3,1)主链与侧链,由磷酸-戊糖交替排列成的链状结构为核酸的主链；,碱基伸展于主链之外，称为侧链。,2)5,-,端与3,-,端,多核苷酸链中，戊糖,C5,上有自由磷酸基的一端，称为5,-,端；而戊糖基的,C3,上有自由羟基者，称为3,-,端。,多核苷酸链,多个核苷酸聚合所形成的链状结构称之。,3,5,主,链,侧,链,A,G,P,5,P,T,P,G,P,C,P,T,P,OH 3,书写方法,5,p,A,p,C,p,T,p,G,p,C,p,T,-,OH,3,5,A C T G C T,3,核酸分子的大小常用碱基,(base,或,kilobase,),数目来表示。,小的核酸片段,(50bp),常被称为寡核苷酸,(,oligonucleotide,),。自然界中的,DNA,和,RNA,的长度可以高达几十万个碱基。,小 结,2.,真核细胞染色质,DNA,与原核细胞生物,DNA,的一级结构特点,（1）,重复顺序,高度重复顺序,中度重复顺序,单一顺序,(,结构基因、单顺反子,),（2）,间隔顺序,与,插入顺序,（常有卫星,DNA）,（内含子、外显子）,（3）,回文结构：舟行水面水行舟,a.,真核细胞染色质,DNA,的结构特点：,间隔顺序,b.,原核细胞染色质,DNA,的结构特点：,（1）基因重叠：同一,DNA,序列包含不同的基因区,（2）多顺反子,一个,mRNA,分子上携带多个结构基因的编码信息,（3）结构基因连续性,原核生物的多顺反子,真核生物的单顺反子,非编码序列,核蛋白体结合位点,起始密码子,终止密码子,编码序列,PPP,5,3,蛋白质,PPP,m,G-,5,3,蛋白质,3.DNA,的二级,结构,Secondary Structure,of DNA,（,1,）,DNA,的二级结构 双螺旋结构,The secondary structure of DNA,DNA double helix,DNA,双螺旋结构是,DNA,二级结构的重要形式，它,是,Watson,和,Crick,两位科学家于1953年提出来的一种结构模型。,DNA,双螺旋结构的研究背景,碱基组成分析,Chargaff,规则：,A,=,T,G,C,碱基的理化数据分析,A-T,、,G-C,以,氢键,配对较合理,DNA,纤维的,X-,线衍射图谱分析,罗莎林德,弗兰克林,Rosalind Franklin,（,1920-1958,）,DNA,双螺旋结构模型要点,（,Watson,Crick,1953）,DNA,分子由两条,相互平行但走向相反,的脱氧多核苷酸链组成，两链以,-,脱氧核糖,-,磷酸,-,为骨架，以,右手螺旋,方式绕同一公共轴盘。大沟,(,major groove),及小沟,(,minor groove),相间。,DNA,双螺旋结构模型要点,（,Watson,Crick,1953）,碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成,氢键,配对,（互补配对形式：,A=T;G,C）。,螺旋直径为2,nm,，,相邻碱基平面距离,0.34,nm，,螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。,亲水性的骨架位于双链的外侧。,疏水性的碱基位于双链的内侧。,骨架与碱基,碱基互补配对,T,A,G,C,DNA,双螺旋结构模型要点,（,Watson,Crick,1953）,氢键,维持双链,横向稳定性,，,碱基堆积力,维持双链,纵向稳定性,。,磷酸基的负电荷与介质中的阳离子的正电荷之间形成的,离子键,。,双螺旋,DNA,的结构特征,1、反向平行,2、右双螺旋：大、小二沟；10,bp/,螺旋，螺,距3.4,nm(34A,0,)；D=2nm(20A,0,),3、,主链骨架位于螺旋外侧，碱基在内,4、副键维系：横向氢键；纵向碱,基堆砌力,5、碱基互补（配对）：,A=T；G C,双螺旋,DNA,的结构特点,（,2,）,DNA,双螺旋,结构的多样性,The Variety of,DNA Structures,1953，,Watson-Crick，,BDNA（,右手螺旋,）,(,right-handed helix),1979，Rich，,ZDNA（,左手螺旋,）,(,left-handed helix),BDNA,ADNA,ZDNA,a.,多种右手螺旋,天然,DNA,在不同湿度、不同盐浓度中结晶，其,X,线衍射所得数据不一样。,B.Z-DNA,左手螺旋。,螺距较大，直径变窄（细长而伸展），只有小沟。,分子长链中磷原子不是平滑延伸而是锯齿排列。,ZDNA,也是天然,DNA,中的一种构象。,意义,：,DNA,的左旋化可能与致癌、突变及基因表达的调控有关。,4.,DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装,-,-,DNA,的三级结构,DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(,superhelix,或,supercoil),DNA,双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(,positive supercoil),盘绕方向与,DNA,双螺旋方同相同,负超螺旋(,negative supercoil),盘绕方向与,DNA,双螺旋方向相反,超螺旋,原核生物,DNA,的高级结构,线状,DNA,形,成的超螺旋,环状,DNA,形成的超螺旋,DNA,超螺旋结构的电镜图象,真核生物,DNA,的高度有序和高度致密的结构,真核生物,DNA,以非常有序的形式存在于细胞核内。,在细胞周期的大部分时间里，,DNA,以松散的染色质,(chromatin),形式存在，在细胞分裂期，则形成高度致密的染色体,(chromosome),。,5.,染色质与染色体,真核生物的染色体,DNA,在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由,DNA,和蛋白质构成，其基本单位是,核小体(,nucleosome),。,核小体的组成,DNA：,约200,bp,组蛋白：,H1,H2A，H2B,H3,H4,DNA,染色质呈现出的串珠样结构。,染色质的基本单位是核小体,(,nucleosome,),。,DNA,染色质的电镜图像,核,小,体,核小体串珠样的结构,双链,DNA,的折叠和组装,DNA,经过多次折叠，被压缩了,8000,10000,倍，组装在直径只有数微米的细胞核内。,6.,基因与基因组,DNA,的基本功能是以,基因,的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，,是在染色体上占有一定空间的特定,DNA,片段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,基因组,指一个生物体内所有遗传信息的总和即,DNA,分子的全序列（,genome),。,人的基因组为,2.810,9,bp,，,3-4,万个可翻译基因。,基因组内,DNA,序列的结构特征,基因序列和非基因序列；,编码序列和非编码序列；,单一序列和重复序列。,基因组学（,genomics,）,:,研究生物体基因和基因组的结构组成、稳定性及功能的一门学科。,由于,DNA,的两条链是互补的，故如果知道一条链的碱基排列顺序，就可推算出另一条链的碱基排列顺序。,如：已知某,DNA,一单链的碱基顺序是,5-,A C G T A C A G,则另一互补单链的碱基顺序是下列哪个？,1、5-,T G C A T G T C,2、5-C T G T A C G T,3、5-U G C A U C U C,（二）,RNA,的种类和分子结构,Category and Molecular Structure of RNA,RNA,是,一条,由核糖核苷酸链形成的具有一定三级结构的大分子化合物。,RNA,与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。,RNA,通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。,RNA,比,DNA,小的多。,RNA,的种类、大小和结构远比,DNA,表现出多样性。,RNA,可以在某些局部弯曲折叠，形成双螺旋式的二级结构。碱基配对关系是,A=U,，,G C,UGCGAU,ACUC,AUCGCA,5,3,U,A,G,C,G,U,A,U,C,G,C,A,5,3,A,C,U,C,Stem-loop,Hairpin,RNA,的种类、分布、功能,*,rRNA,的结构,*,rRNA,的功能,参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,1.,核蛋白体,RNA,的结构与功能,*,rRNA,含量最多，,占总,RNA,的,80%,。,核蛋白体的组成,原核生物（以大肠杆菌为例）,真核生物（以小鼠肝为例）,小亚基,30S,40S,rRNA,16S,1542,个核苷酸,18S,1874,个核苷酸,蛋白质,21,种,占总重量的,40%,30,种,占总重量的,50%,大亚基,50S,60S,rRNA,23S,5S,2940,个核苷酸,120,个核苷酸,28S,5.85S,5S,4718,个核苷酸,160,个核苷酸,120,个核苷酸,蛋白质,34,种,占总重量的,30%,40,种,占总重量的,35%,*,rRNA,的种类（根据沉降系数）,真核生物,5S rRNA,28S rRNA,5.8S rRNA,18S rRNA,原核生物,5S rRNA,23S rRNA,16S rRNA,小亚基,大亚基,真核生物,原核生物,16S-rRNA,23S-rRNA,5S-rRNA,18S-rRNA,28S-rRNA,5.8S-rRNA,5S-rRNA,真核细胞中有四种,rRNA,，原核细胞有三种。,2.,转运,RNA,的结构与功能,（,Transfer RNA,tRNA,）,书写方法：,tRNA,Phe,代表转运苯丙氨酸的,tRNA,tRNA,中含有多种稀有碱基,由,73,93,核苷酸组成；,占细胞总,RNA,的,15%,；,种类很多，每一种氨基酸都有对应的一种或几种,tRNA,。,tRNA,中含有多种,稀有碱基,稀有碱基,（,rare base,）是指除,A,、,G,、,C,、,U,外的一些碱基。,*,tRNA,的二级结构,三叶草形,氨基酸臂,DHU,环,反密码环,额外环,TC,环,氨基酸,臂,额外环,氨基酸结合点,*,tRNA,的三级结构,倒,L,形,*,t,RNA,的功能,活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,tRNA,在蛋白质合成中起转运氨基酸的作用。,AA-COOH,tRNA,在蛋白质合成中起转运氨基酸的作用。,AA-CO,密码子和反密码子互补配对,3.,信使,RNA,的结构与功能,（,Messenger RNA,mRNA,）,mRNA,的种类多，含量少，半寿期短。,有一种蛋白质就相应有一种,mRNA,。,数量占总,RNA,的,3-5%,。,代谢活跃，半寿期只有几小时到几天。,hnRNA,内含子,(intron),mRNA,*,mRNA,成熟过程,外显子,(exon),mRNA,的前体是,hnRNA,，在核内。移到胞液中变成成熟的,mRNA,。,mRNA,是蛋白质合成的直接模板。,它能将核内,DNA,的遗传信息携带到胞液，,作为蛋白质合成的模板，决定蛋白质中的氨,基酸顺序。,具体说来，是以其分子上每三个核苷酸为,一组,(,密码子,),，表示肽链上的某一个氨基酸。,5-m,7,GpppN,AAA AAA,.,真核生物的,mRNA,的结构特点是：,5-,端有帽子结构，,3-,端有尾巴结构。,1,、帽子结构：,7-,甲基鸟嘌呤,-,三磷酸核苷（,m,7,GpppN,）,2,、多聚,A,尾：,polyA,，数十个至百余个,A,连接而成。,mRNA,核内向胞质的转位,mRNA,的稳定性维系,翻译起始的调控,帽子结构和,多聚,A,尾的功能,M,7,Gppp,GUG,UAA,AAAAAn,AUG,5-,帽子结构,5-,非翻译区,密码子,编码区,3-,非翻译区,3-,多聚,A,尾,哺乳动物成熟,mRNA,的结构特点,5,3,编码情况,原核生物,多顺反子,，即1个,mRNA,分子编码可,作为多种多肽链合成的模板。,转录与翻译同时进行,真核生物,单顺反子,，即1个,mRNA,分子只编码,一条多肽链。,转录与翻译分开进行,DNA,mRNA,蛋白,转录,翻译,原核细胞,细胞质,细胞核,DNA,内含子,外显子,转录,转录后剪接,转运,mRNA,hnRNA,翻译,蛋白,真核细胞,核,蛋,白,体,蛋白质 核酸,组成单位 氨基酸 核苷酸,组成单位,20,种氨基酸,A,、,C,、,G,、,T,的种类,（,DNA,）,A,、,C,、,G,、,U,（,RNA,）,核酸与蛋白质的比较（组成，结构，功能）,连接方式 肽键 磷酸二酯键,CONH,一级结构 氨基酸排列顺序 碱基序列,空间结构 二、三、四 双螺旋、超螺,级结构 旋、蛋白质,-,核,酸的非共价结,合等,功能 生命活动中各 遗传信息的贮,种功能的直接 存、传递、表达,执行者,决定蛋白质的结构,核 酸 的 理 化 性 质,The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid,第 二,节,一、核酸的一般性质,：,核酸是生物大分子，故具有大分子的一般特性。,DNA,是线性大分子，酸性强，粘度大。,但变性后其粘度会降低。,RNA,分子较小，粘度也较小。,RNA,和,DNA,都是极性化合物，故溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂。且其钠盐的溶解度更大。,核酸也是两性电解质，也能进行电泳。,核酸中的嘧啶和嘌呤含有共扼双键，对,260nm,的紫外线有最大吸收，可用于核酸的定性定量分析。,1.DNA,或,RNA,的定量,OD,260,=1.0,相当于,50,g/ml,双链,DNA,40,g/ml,单链,DNA,（或,RNA,）,20,g/ml,寡核苷酸,2.,判断核酸样品的纯度,DNA,纯品,:,OD,260,/OD,280,=1.8,RNA,纯品,:,OD,260,/OD,280,=2.0,OD,260,的应用,二、核酸的变性、复性和杂交,理化因素破坏氢键和碱基堆积力，使核酸分子空间结构改变，从而引起核酸的理化性质和生物学功能发生改变，称为核酸的变性。,1,、概念：,DNA,变性的本质是双链间氢键的断裂,变性只涉及空间结构的破坏，不影响一级结构。,部分变性,DNA,的电镜图像,2,、变性因素,包括加热、强酸强碱，有机溶剂，尿素等。实验室中最常用加热变性的方法。,3,、变性,DNA,的改变,DNA,变性后，溶液的,OD,260,增加,的现象称为高色效应（或增色效应）。,机理：,DNA,变性时，双链分开，碱基暴露，故对紫外光吸收增加。,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA,的紫外吸收光谱,4,、,Tm,（解链温度；融解温度）,加热,DNA,溶液，紫外光的吸收度达到最大值一半时的温度，（,或,DNA,分子,50%,双链结构被解开时的温度,）就是,DNA,的解链温度（融解温度，,Tm,）。,其大小与,G+C,含量成正比。,Tm=4(G+C)+2(A+T)(20bp,时）,G+C,含量越高，解链温度就越高。,解链,曲线,的变化,三、,DNA,的复性与分子杂交,DNA,复性,(renaturation),的定义,在适当条件下，变性,DNA,分开的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为,复性,。,减色效应,DNA,复性时，其溶液,OD,260,降低。,热变性的,DNA,经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为,退火,(annealing),。,DNA,复性,在,DNA,变性后的复性过程中，不同来源的,DNA,或,RNA,分子只要在某些区域存在碱基配对的关系，在适宜的条件下，就可以形成,杂化双链，,称为核酸分子杂交。,这种杂化双链可以是,DNA-DNA,、,DNA-RNA,或,RNA-RNA,核酸分子杂交,(hybridization),核酸分子杂交,核酸分子杂交的应用,研究,DNA,分子中某一种基因的位置,分析两种核酸分子间的序列相似性,检测某些专一序列在待检样品中存在与否,是基因芯片技术的基础,第三节 核酸的分离与含量测定,重要原则,1,保证核酸一级结构的完整性；,2,排除其它分子的污染，保证核酸分子的纯度。,一、核酸的提取、分离和纯化,可以采取的,措施,：,1,、简化步骤，缩短分离时间，减少对核酸的破坏,2,、避免极端酸碱环境及高温，避免剧烈震荡,3,、抑制核酸酶的活性（,DNase,和,RNase,）,4,、防止核酸的生物降解,5,、减少物理因素对核酸的降解，如高温、机械剪切力,（一）,DNA,的分离纯化,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,样品,取上清液,氯仿：异戊醇（24：1）再抽提一次,盐类、无水乙醇沉淀核酸,核酸析出,取上清液,（三）核酸的纯度检测,纯,DNA,的,A260/280,为,1.8,纯,RNA,的,A260/280,为,2.0,A260/A280,比值是纯度检测的重要指标。,（二）,RNA,的分离纯化,应用,DEPC（,焦碳酸二乙酯）,二、核酸含量的测定,1、定磷法:,RNA,平均含磷9.4%，,DNA,平均含磷9.9%,2、定糖法,3、紫外吸收法,The End,