第六章工业微生物诱变育种.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 工业微生物诱变育种,微生物的,诱变育种,是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。,工业微生物育种过程分为三个阶段:,1、菌种基因型改变；,2、筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株；,3、产量评估，全面考察此变异株在工业化生产上的接受性。,目的：,1、提高有效产物的产量,2、改善菌种特性、提高产品质量,3、简化工艺条件,4、开发新品种,第一节 诱变育种的试验设计和准备,工作,变异对微生物本身来说使其代谢向着异常方向发展，必然引起菌体基本代谢失调，此时菌体虽然具有生活能力，但细胞的某些功能却显著地降低了。,高产突变型是一种数量性状的遗传变异，是由多基因决定的。结构基因、调节基因、渗透基因、辅助基因等，这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变。,诱变育种,工作包括,诱发突变,、,突变株的筛选,和,高产突变株最佳环境条件的调整,。,诱发突变,包括,出发菌株,、,诱变剂,及其,剂量的选择,、,影响诱变效果的因素,。,突变株的筛选,包括,筛选培养基和培养条件,及,选择一个简便、快速、有效的筛选方法,。,环境条件调整,是,突变株的最佳培养条件改变。,具体要选育怎样的菌种，在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和全面的了解。,诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为7-10d的抗生素菌种来说，一代诱变需2-3个月。,三、了解影响菌种生长发育的主要因素,1、培养基,2、培养基斜面制备技术,3、移种的密度,4、温度,5、湿度,6、药品和原材料质量,四、了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养条件的关系。,五、建立一个准确、简便、快速检测产物的方法,六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件,第二节 诱变育种的步骤与方法,诱变育种的步骤和方法包括,：,出发菌株的选择；,单孢子（或单细胞）菌悬液的制备；,诱变剂及诱变剂量的选择；,诱变的处理方法；,以及菌种的纯化分离等。,一、出发菌株,1、对一般出发菌株的要求,2、选择具有一定生产能力或某种特牲的菌株作为出发菌株,3、选择纯种作出发菌株,诱变中要选用单倍体、单核或少核的细胞为出发菌株。,4、选择出发菌株应考虑其稳定性,5、连续诱变育种如何选择出发菌株,“增变菌株”-缺乏DNA修复机制,6、选择出发菌株的其他因素,7、采用多出发菌株,8、菌种代谢特点,二、出发菌株的纯化,纯种分离方法:,常用,划线分离法,和,稀释分离法,。,显微镜操纵器分离单孢子,三、单孢子（或单细胞）悬液的制备,1、供试菌株的孢子或菌株要年轻、健壮,。,对数期,霉菌孢子浓度约为10,6,/ml，放线菌孢子约为10,6,10,7,/ml。,菌悬液的孢子或细菌数可用平皿计数，血球计数器计数或光密度法测定。,制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制。,2、菌悬液的制备方法,细菌：,最好在诱变处理前进行振荡预培养，这不仅使菌体分散，得到单个细胞，还可利用温度和碳源控制其同步生长，取得年轻的、生理活性一致的细胞；,孢 子：,在试验中应尽量采用成熟而新鲜的孢子，并且置于液体培养基中振荡培养到孢子刚刚萌发，即芽长相当孢子直径的0.51倍、离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液制成孢子悬液，用血球计数法进行计数，调整菌体浓度。,不产孢子的,菌丝体,进行诱变处理,有三种方法:,第一、菌丝尖端法；,第二、处理单菌落周围尖端菌丝；,第三、混合处理法。,3、制备原主质体作为诱变材料,（1）在丝状真菌中,（2）细胞具有细胞壁,（3）不产生孢子丝状菌,四、诱变剂及诱变剂量,（一）诱变剂种类的选择,实践证明并非所有的诱变剂对某个出发菌株都是有效的。一种诱变剂对A菌株有较高的诱变效应；对B菌株则可能相反。不同微生物对同一种诱变剂敏感性有很大区别。,1、选择诱变剂,选择诱变剂时要注意选择专一性比较强的诱变剂。,2根据菌种特性和遗传稳定性选择诱变剂,3,参考出发菌株原有的诱变系选择诱变剂,（二）最适诱变剂量的选择,由于各种微生物间遗传特性的差异，不同微生物或同一种微生物的各个菌种对同一种诱变剂的最适剂量是有区别的。,在实际育种工作中，具体到某个菌种对某种诱变剂最适剂量的确定，作突变剂量曲线是比较可靠的。,在判断诱变剂量时，采用抗药性突变是比较可靠的。,剂量的大小常以致死率和变异率来确定,。,五、诱变剂的处理方式,可分为,单因子处理,和,复合因子,处理。,单因子处理,，是采用单一诱变剂处理，一般认为单因子不如复合因子处理效果好，这己经被很多事实所证实。,但当一种诱变剂对某个菌株确实是有效的诱变因子，那么单因,子,处理同样能够引起基因突变，效果也不错单一诱变剂处理，还可以减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工作趋向简单化。当然单因子处理，一般情况突变率比复合因子要低，而且突变类型也比较少。,复合因子处理,是指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。,又可以分为以下处理方式：,1、两种以上因子同时处理,2、不同诱变剂交替处理,通常以化学因子和物理因子交替进行效果较好。,3、同一种诱变剂连续重复使用,经过一种诱变剂处理后的菌悬液，培养数小时之后（细菌或酵母），使细胞分裂1-2代，接着再处理，有时还可反复多次，最后进行分离筛选。诱发能力强的、对基因作用较为广谱的诱变剂可连续重复使用，有益于变异乎的提高。但是单因子连续使用代数不能过多，否则也会出现“钝化”现象。,4、紫外线光复活交替处理,经紫外线照射后的菌体或菌悬液，暴露在日光中一定时间，接着用剂量更大的紫外线继续照射，然后再让其光照复活，经多次紫外线照射和光照复活交替，可以增加变异率，提高变异幅度。,5、诱,变,剂处理时间与诱变效应的关系,在头孢菌素C产生菌选育中用甲基磺酸乙酯低浓度、长时间处理与高浓度、短时间处理的诱变效应是不同的，在致死率大致相同的情况下，前者比后者不仅正突变率高，而且提高的幅度也大,。,处理具体方法,1、直接处理方式，将菌悬液用物理、化学因子处理，然后分离，直接处理是最常用的方式。,2、生长过程处理，适用于诱变作用强的而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、秋本仙碱等,。,六、影响突变体的因素,（一）菌种遗传特性不同,（二）菌体细胞壁结构,丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗人细胞，减弱与DNA的作用。一般加大诱变剂量，效果会好一些。有的微生物细胞壁含有蜡质，常用一定浓度的洗衣粉、脂肪酶处理，除去蜡质，提高诱变效果。,（三）环境条件的影响,1、诱变前预培养和诱变后培养,出发菌株不管在诱变前或诱变后进行培养时，营养丰富的培养基中出现,突,变株的数量总是比营养贫乏的培养基中多。,后培养,是指诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。,诱变处理后保存于冰箱中的菌体悬液成分会影响突变体的成活率，应加一些使正突变个体和总菌数的死亡率减低的物质，如酪素水解蛋白、色氨酸等。,2、温度、pH值、氧气等外界条件对诱变效应的影响,3、平皿密度效应,第三节 突变株的分离与筛选,对抗性突变株或营养缺陷突变株,，常常用选择性培养基进行,筛,选。,对产量突变来说,，由于高产菌株和负变菌菌株都能在同一个培养基上生长，难以采用选择性培养法进行筛选。,筛选突变株，首先根据筛选目的进行。由于微生物正突变概率极小，仅0.050.2%，产量提高10以上突变株也只有1/300，所以挑选的菌落愈多，概率就愈高。,投产率,多数不宜投产,少数适宜投产,大多死亡,少数存活,存活率,多数未变,少数突变,突变率,多数负变,少数正变,正变率,多数幅度小,少数幅度大,高产率,出发菌株,诱变,一、诱变育种的基本环节,二、筛选的程序,1、常规筛选程序,这是传统选育中常用的方注，挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定。,2、简便法筛选程序,在常规筛选法甚础上进一步改进：一方面分离在平皿上的菌落采用琼脂块法，每代诱变处理后打10003000块琼脂菌落，甚至更多、另一方面，初筛摇瓶发酵液中产物分析，采用简便、快速的琼脂平板测定祛或其他简便方法。,设计或采用高效筛选方案或方法,一个出,发菌株,诱变剂,处理,选出,200,个单,孢子菌菌株,初筛,（每株,1,瓶）,选出,50,株,复筛,（每株,4,瓶）,选出,5,株,第一轮,第二轮,五个出发菌株,初筛,（每株,1,瓶）,选出,50,株,复筛,（每株,4,瓶）,选出,5,株,40,株,40,株,40,株,40,株,40,株,诱变剂,处理,三、分离和筛选,多级水平筛选中经过平板筛选。留取5-10%，约挑选200株；第二阶段是摇瓶初筛，选取25-30，第三阶段摇瓶复筛，选出1-3株高产变株。有条件再进行小型发酵罐试验。,（一）随机筛选,也称摇瓶筛选。主要是随机挑选的平皿菌落进行摇瓶筛选。初筛挑选菌落起码要200个。,（二）平板菌落预筛,1、根据形态筛选变株,2、根据平皿生化反应筛选突变株,透明圈、显色圈、抑制圈及混浊圈等生化反应来筛选。,3、采用冷敏感菌筛选抗生素突变株,4、浓度梯度法,5、应用复印技术快速筛选突变体,6、琼脂块法筛选变株,四、摇瓶液体培养,常规随机筛选的全过程，都要通过摇瓶培养，而平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后，弃去大量低产菌株，被挑选的菌落移入试管斜面，然后再迸行摇瓶液体培养；才艳逐步地筛选出高产菌株。,五、产物活性测定,1、琼脂平板活性圈法,2、滤纸片法,3、琼脂薄层纸片法,筛选菌种为一种重复性和计量性的工作，所以必须应用统什方法。区别并肯定其产量上的差异。以便迸行下轮育种的评估。,六、摇瓶数据的调整和有观菌株特性的观察分析,对摇瓶发酵液的测试数据要尽量应用生物学统计方法来处理，以便从复杂的差异中，去伪存直，由比及彼，抓住本质，找出其中真正的规律性。,七、培养基和培养条件的调整,培养基和培养条件的调整，常采用正交法和二次旋转均匀设计。,八、变种的特性研究与鉴定,要研究菌种的纯度、遗传稳定性、菌落类型、群体的形态、生活能力、产孢子多少，保藏培养基及保藏方法、菌种碳、氮源利用情况、菌丝生长速度、菌丝量、发酵液粘度、过滤难易状况；注意考察菌种抗生素的组分变化，色素等质量问题；研究最适移种期、移种量、通气搅拌、温度、pH等。,优良菌株选育后，还应该从分子水平进一步对变株的生理生化特性加以鉴定以全面了解菌株各种属性这是考核菌株突变的重要指标，也是为菌株迸一步的研究和应用提供有指导意义的参考数据。,九、诱变育种实例,（一）碱性脂肪酶高产变株FS1884的选育,1原生质体作为诱变材料,2采用定向控制的理性筛选抗阻遏和解除反馈抑制筛选模型,3初筛来用大通量的琼脂块法,4结合饰变育种,1原生质体作为诱变材料,制备原生质体，用0.6纤维素酶+0.6%蜗牛酶处理3h，0.6 NaCI0.3%CaCl2作稳定剂，可获得原生质体。采用麸皮琼脂粉作为再生培养基。,将菌体制备成原生质体后，用UV、和He-Ne，激光进行诱变。经筛选发现，原生质体对诱变剂的敏感性要比孢子大得多。,2采用定向控制的理性筛选抗阻遏和解除反馈抑制筛选模型,脂肪酶和其他水解酶类同样受终点产物或分解代谢产物阻遏的调节，琥珀酸钠是脂肪酶的产物类似物，是该酶合成的阻遏物结构类似物，因此可以用琥珀酸钠来筛选抗阻遏突变株。筛选高渗透性菌株以解除胞内产物反馈抑制作用，达到提高酶产量的目的。,制霉菌素能抑制真菌细胞膜麦角固醇的合成，引起胞膜透性的改变，可以用它师选高渗透型突变株。将琥珀酸钠和制霉菌素分别以一定浓度加人到分离平板、有抗性的菌落陆续长出，这样大幅度的浓缩了所需要筛选的菌株，加速育种的进度,从75U/ml逐步提高到7800U/m。,3初筛来用大通量的琼脂块法,把琼脂块的菌落培养到产酶高峰期，然后移至油脂乳化液作为底物的鉴定平板上；在一定温度下培育后，根据透明圈出观快慢、大小及清晰度来决定取舍。每代诱变后可挑取菌落l000一3000株，在初筛阶段可淘汰约95%低产菌株，这样大大提高了筛逸的工作效率。,第五节 温敏突变株的筛选,温敏突变株（,temperature-sensitive mutant,TS突变株）,：,在许可的温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别，在非许可的温度条件下不能生长或微弱生长，表型和野生型不同。,一 温敏突变株的特性,1、主要是必须基因的突变,2、错义突变或移码突变,二 温敏突变株的筛选方法,1、诱发,抗生素法,2、富集 过滤或离心法,H3-前体法,3、分离筛选,常规法和特殊分离筛选,三 温敏突变株在发酵工业中的应用,1、TS突变株在谷氨酸的发酵中的应用,2、TS突变株在丝氨酸发酵中的应用,3、微生物单细胞蛋白的生产,第六节 抗噬菌体菌株的选育,一、烈性噬菌体及其效价的测定,一般情况下每种噬菌体所形成噬菌斑的形态是相对稳定的，但有时也随着寄主生理状态、菌龄及培养条件不同而变化。噬菌斑的这些形态特征可以作为鉴定指标，也可利用其进行纯种分离和计数。,每毫升试样中所,含,有的侵染性的噬菌体粒子数称为效价，,以下是几种噬菌体的分离和效价测定方法。,1重层琼脂法,2单层平板法,3快速测定法,4斑点试验法,二、温和性噬菌体及溶原菌,微生物中溶源菌广泛存在于细菌中，在发酵生产中也不可忽视温和性噬菌体的感染，尤其在选育抗噬菌体菌株时，要注意区别真正抗性菌株和溶源性菌株。,检验溶源菌的方法,是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌相混合，加入琼脂培养基倒平板。培养一段时间后，溶源菌长成菌落。由干溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解，其释放的噬菌体可不断感染溶源菌周围的敏感菌所以会产生一个个中央有溶源菌的小菌落，四周有透明圈的特殊噬菌斑。,三、,抗噬菌体菌株的选育程序:,专一性噬菌体的获得和纯化,高效价噬菌体原液制备 菌株诱发突变 分离在含有噬菌体的平皿 挑取抗性菌落和摇瓶培养(加噬菌体)分离到含噬菌体的平皿上 挑取抗性菌落 抗性菌落特性测试,1专一性噬菌体获得和纯化,2高效价噬菌体原液的制备,3噬菌体原液效价的测定,效价（Uml）=平均每皿噬菌斑数稀释倍数取样量,4菌株诱变和分离,5液体摇瓶振荡培养,6进一步考查抗性菌株对周围环境中存在的各种噬菌体的抗性,四、抗性菌株的特性研究,1抗性菌株稳定性试验,2抗性菌株的产量性能,五、抗噬菌体菌株选育的实例,金霉素链霉菌作为选育抗噬菌体菌株的出发菌株。,乳酸菌作为选育抗噬菌体菌株的出发菌株。,