肿瘤细胞增殖动力学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,肿瘤细胞增殖动力学,细胞生物学系,刘清华,bjqinghual,1,What Kind of Disease Is,Cancer?,2,Some Cases,病例1：,男性76岁，2003年9月3日因干咳、少,痰、消瘦就诊。,CT检查确诊肺癌,3,病例3：,女性43岁，因上腹部时有疼痛伴返酸2,年、加重1个月入院。,胃镜活检报告：胃幽门部黏膜内低分化,癌。,4,病例8：,患者男性，34岁。因发现右锁骨肿块3月入院。,检查右锁骨外段稍隆起，局部膨大，表面皮,肤无红肿或静脉怒张，无疼痛；肩关节活动,稍受限。,X光示右锁骨外段明显骨质破坏及增生。,病理报告为右锁骨恶性淋巴细胞瘤。,5,病例11：,女性68岁，阴道不规则流血4-5个月。,妇科检查：子宫前位，如妊娠2月大小，可触及数,个结节，质地中等。,超声检查提示子宫混合性占位性病变。,CT诊断：宫体癌，右侧卵巢囊肿。,病理诊断：子宫恶性混合性苗勒氏瘤，累及输尿,管。,6,2.,What We Have Known,about the Cell Cycle Control?,9,Oncogene,Antioncogene,Checkpoints,Cell Division Cycle Gene,cdc genes,;,Cyclins,Cyclin Dependent Kinases,CDKs,Cyclin Dependent Kinases Inhibitors,CDKIs,S phase Promoting Factor,SPF,Maturation Promoting Factor,MPF,蛋白质水平,基因水平,10,3.How to Control in a,Normal Cell?,11,Control of G,1,phase,Control of S phase,Control of G,2,phase,Control of M phase,12,Control of G,1,phase,Proliferation factors,Checkpoint,（G,0,G,1,entrance、R Point G,1,S）,Cyclin-CDK,（cyclinD-CDK46、cyclinE-CDK2）,P105,RB,CDKI,13,14,Control of S phase,Checkpoint(DNA synthesis on、off),CyclinCDK,PCNA,15,SPF(cyclinA-CDK1),CyclinE-CDK2 作为启动蛋白，识别autonomously replicating sequence，ARS，激活复制起点,可能是origin recognition complex，ORC 的组成部分,CyclinCDK,16,17,PCNA,细胞增殖核抗原,DNA聚合酶,的亚基,直接参与DNA复制和修复,18,Control of M phase,Checkpoint,MPF,（cyclinB-CDK1),19,Checkpoint,G,2,M：DNA复制没有完成，激活wee1 -mik1蛋白激酶，细胞阻滞于G,2,期。,M中晚期：检查微管蛋白的量、微管组织中心功能、纺锤体极性、微管与动粒附着、或附着在动粒上产生的张力。,20,MPF的活性调节,21,4,.Whats Wrong in a,Tumor Cell?,22,oncogene,的过表达,antioncogene,的失活,cyclin,基因和表达蛋白的异常,cdki,基因和表达蛋白的异常,23,5,.How to Evaluate Cell,Proliferation?,24,Cell Proliferation Kinetics,研究生物体内各种细胞群体在新生、增殖、消亡过程中处于各种状态的细胞数量、时间参数和分布位置的技术手段。,25,检测方法,1.,细胞计数,2.,生长曲线,3.,倍增时间,4.,生长分数,26,5.,丢失系数,6.,标记指数,7.,分裂指数,8.,细胞周期参数,27,1.Cell Counting,直接计数台盼蓝计数法,比色半定量,四唑盐法,28,四唑盐法,3-4,4-二甲基噻唑2，5二苯基四氮唑溴盐，简称MTT;,线粒体的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物;,比色测定间接反映活细胞数量。,29,细胞培养,显色:加入MTT溶液(5mg/ml)，继续,培养4h，加DMSO，振荡10min,比色,：490nm波长测定光吸收值,30,Breast Cancer Research and Treatmeat 2004;84:251-260,6.Their Research Strategy?,7.The Technology They Used?,31,2.Growth Curve,Cell culture;,Cell counting：每次至少3瓶，每瓶至少3次，取平均数；共做7天；,作图：培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，在对数坐标纸上作图。,32,0.1,0,2,4,6,8,10,Time/day,Cancer Cell,Normal Cell,0.1,1,10,100,1000,单层培养,Cell Number,0.1,33,0,2,4,6,8,10,Time/day,0.1,1,10,100,1000,Cell Number,悬浮培养,Normal Cell,Cancer Cell,34,35,3.Doubling Time,In vivo,:,DT=0.1,t/log D,t,log D,o,D,o,:首次测得的肿瘤直径（cm）,D,t,:t 时间后测得的直径（cm）,36,Computed Tomography,37,某转移癌：,D,o,2，D,t,4，t90,DT=0.1,90/0.6-0.3=30(d),effective doubling time,TD,eff,：考,虑细胞丢失因素的细胞倍增时间,potential doubling time,TD,pot,：不,考虑细胞丢失因素的细胞倍增时间,38,原发性肺癌,腺癌 64 21,鳞癌 85 12,间变性癌 55 11,乳腺癌 17 14,结直肠癌 19 90,淋巴瘤 27 4,肿瘤类型,病例数,倍增时间（周）,780例人体肿瘤体积倍增时间,Steel（1977）（未完）,39,4.Growth Fraction，GF,肿瘤中增殖细胞占细胞总数的比例,GF=P/P+Q,P:proliferation,Q：quiescent,40,5.丢失系数,丢失系数,KL/KB,KL：细胞群体在增殖过程中的丢失率,KB：细胞群体在增殖过程中的生成率,41,6.Labeling Index,LI,LINs/N,Ns:Number,s phase,42,常用方法：,3,H-TdR,BrdU,PCNA,、,Ki67,43,3,H-TdR,3,H-TdR和细胞短暂孵育；,间隔时间取材；,放射自显影；,图像分析仪计数或液闪计数；,SPSS 统计分析。,44,45,BrdU,BrdU和细胞共孵育较长时间；,取材固定；,加入BrdU抗体；,加入生物素标记的二抗；,46,加入链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶；,DAB显色；,图像分析仪计数；,SPSS 统计分析。,47,Chinese journal of Cancer 2003;22(11):1127-1134,48,PCNA,取材固定；,加入PCNA抗体；,加入生物素标记的二抗；,加入底物；,显色；,图像分析仪计数；,SPSS 统计分析。,49,Synovial sarcoma Immunohistochemical Strong staining of PCNA,J.Vet.Sci2004;5(2):173-180,50,Ki-67,Positive staining for Ki67,Cancer Cytopathl 2004;102:142-9,51,7.Mitotic Index，MI,经典方法,免疫荧光方法,52,经典方法,Synovial sarcome.Mitotic figures J.Vet.Sci2004;5(2):173-180,J Nippon Med Sch 2003;70（3）219-226,53,免疫荧光方法,54,8.Parameter of Cell Cycle,T,c,、,T,G1,、,T,s,、,T,G2,和,T,M,；,常用的有,3,H-TdR标记法和流式细胞,技术,flow cytometry,55,Flow Cytometry,利用流式细胞仪flow cytometre，FCM,细胞快速、准确、多参数的定量分析,体积，DNA含量、蛋白质含量、酶活,性、细胞膜受体量、表面抗原量等等,56,57,无菌分类收集活细胞。,58,Breast Cancer Research and Treatment 2004;84:251-260,59,60,应用,肿瘤的周期化、同步化治疗,LI检测对化疗药物的敏感性,提示疗效和预后,癌前病变的检测,完,61,作用特点,药物名称,非细胞周期特异性,氮芥、其他氮芥类(氮化芥)、芥丁酸等,细胞周期特异性,（G1期药物）,环磷酰胺、噻替派、溶肉瘤素、双氯乙亚硝基脲、放线菌素D、红比霉素、光辉霉素、链氮霉素。氟尿嘧啶,时相特异性,（S期药物）,3H胸腺嘧啶核苷、阿糖胞苷、脱氧核苷、氨甲蝶呤、羟基脲、重氮丝氨酸、喜树碱,时相特异性,（M期药物）,秋水仙素、长春花碱、长春新碱,62,Thank you,63,64,65,66,67,68,癌分子细胞生物学,癌相关基因,癌遗传学,环境致癌,69,