实时荧光定量PCR技术-原理-应用及实践.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处输入标题,Company name,实时荧光定量PCR技术 原理 应用及实践,2,北京康为世纪生物科技有限公司,康为的目标：成为中国的,Invitrogen,您的问题解决专家！,3,北京康为世纪生物科技有限公司,分子,生物学,核酸提取,PCR,、,RT-PCR,及荧光定量,PCR,DNA,分子量标准,克隆与转化,蛋白质,学相关,蛋白提取与纯化,蛋白定量、蛋白,Marker,及蛋白电泳产品,Western Blot,产品,免疫学,相关,免疫组化产品、免疫沉淀,标签抗体,内参抗体,二抗,完善的产品线,4,五大平台,一站式服务,5,园区公共服务平台,2010,年康为世纪公司依托江苏省泰州市政府及中国医药城的支持政策，成立,江苏康为世纪,，主要进行创新的临床诊断试剂的研发、生产与相应的技术服务，,占地面积约,3300,平米,2700,平米的实验区,:,临床生化诊断试剂研发平台,免疫诊断试剂研发平台,分子诊断试剂研发平台,免疫组化诊断试剂研发平台,约,300,平米,GMP,标准的生产车间,总投资,6500,万元,泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与生产公共服务平台,6,荧光定量,PCR,仪,芯片点样仪,芯片扫描仪,全自动核酸提取仪,超速离心机,焦磷酸,DNA,测序仪,分子生物学平台,凝胶成像仪,泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与生产公共服务平台,芯片杂交仪,康为世纪生物科技有限公司,7,完善的产品线,分子生物学,全系列产品,蛋白质学产品,免疫学相关产品,一站式服务平台,实验设计平台,分子生物学平台,蛋白表达与纯化,平台,抗体制备纯化平台,免疫学检测平台,北京康为世纪生物科技有限公司,我们的客户,我们的合作伙伴,北京大学、清华大学、,复旦大学等,中国科学院协和医院、,上海瑞金、军事医学,科学院,301,医院、医院,华大基因、诺华制药,九强、博奥等,用我们的产品发表的部分,SCI,文章,a-Bisabolol induces dose-and time-dependent apoptosis in HepG2 cells via a Fas-and mitochondrial-related pathway,involves p53 and NFkB,State Key Laboratory of Virology,College of Life Sciences,Wuhan University,Wuhan 430072,China,CCR4-NOT Deadenylates mRNA Associated with RNA-Induced Silencing Complexes in Human Cells,State Key Laboratory of Molecular Biology and Cell Biology,Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,China,Coadministration of huperzine A and ligustrazine phosphate effectively reverses scopolamine-induce damnesia in rats,School of Pharmacy,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,PRChina,Effects of Microgravity Modeled by Large Gradient High Magnetic Field on the Osteogenic Initiation of Human Mesenchymal Stem Cells,CCR4-NOT deadenylates RISC-associated mRNA in human cells,State Key Laboratory of Molecular Biology,Institute of Biochemistry and Cell Biology Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Science shanghai,china,主要内容,Company name,Real-time qPCR,的定量原理,2,Real-time qPCR,的检测方法,3,Real-time qPCR,的基本概念,1,Real-time qPCR,的解析方法,4,PCR,：伟大的天才发明,Use of LSD,Synthesis and,self-testing of novel psychoactive substances,Belief in astrology,PCR,：基本原理,Denaturation:,94 96C,Annealing:,50 65C,Extension:,70 75C,基本要素：,Template,Primers,DNA polymerase,dNTP,N=A,G,C or T,PCR,：基本原理,Company name,理想的,PCR,反应：,N=N,0,*2,n,实际的,PCR,反应：,N=N,0,*,(1+E),n,N,0,：初始模板量,N,：第,n,次循环后的产物量,n,：扩增反应的循环次数,E,：扩增效率,S,形曲线，具有平台效应,Company name,与普通,PCR,的对比,同一个样本进行,96,次重复,传统,PCR,检测,Real time PCR,检测,Real time PCR-,起点检测,：,-,起点量是样本中起始的,DNA,量,-“,加入了,500,个拷贝”,-,具有重现性，误差小,传统,PCR-,终点检测,：,-,终点产物量经过,PCR,放大的,DNA,量,-“,生成了,500,，,0000,，,0000,个拷贝”,-,不恒定，误差大,传统,PCR,检测,Real-time qPCR,激发光,发射光,-,在,PCR,反应体系中加入荧光基团。,-,荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。,-,利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。,荧光基团,扩增曲线,（primary curve,）,Company name,扩增曲线：,随着,PCR,反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。,纵坐标：,Rn,（荧光值）横坐标：,cycle number,（循环数）,线性图,对数图,Company name,荧光阈值（,threshold,）,基线,(baseline),：,一般以,PCR,反应前,15,个循环的荧光信号作为本底信号,荧光阀值,(threshold),：,扩增曲线上人为设定的一个值,-,缺省设置：,PCR,反应前,3-15,个循环荧光本底信号标准偏差的,10,倍,-,手动设置：大于样本的荧光背景值,C,t,值,(Cycle Threshold),Company name,Ct,值,：,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的,PCR,循环次数。,起始模板量 基线 阈值,Ct,值,C,t,值,(Cycle Threshold),Company name,Ct,值的特点,：,相同模板进行,96,次扩增，平台期,DNA,拷贝数波动很大，但,Ct,值相对固定；,Ct,值则极具重现性,Ct,值可以确定初始模板量？,R,n,=R,B,+X,0,(1+E),N,*R,S,第,n,个循环的总信号,=,本底信号,+,起始,DNA,数目*,PCR,扩增效率*单位信号强度,当循环次数,n=Ct,时,R,Ct,=R,B,+X,0,(1+E),Ct,*R,S,两边同时取对数得,:,lg(R,Ct,-R,B,)=lgX,0,+Ctlg(1+E)+lgR,S,Ct=-lgX,0,/lg(1+E)+lg(R,Ct,-R,B,)-lgR,S,/lg(1+E),Ct=-klgX,0,+b,Company name,lgX,0,与,Ct,值呈线性关系,根据,Ct,值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数,起始拷贝数越多，,Ct,值越小。,Company name,Rn vs.Cycle number-,扩增曲线,LogDNA vs.Ct-,标准曲线,.,未知,10,4,10,3,10,6,10,5,10,2,10,标准曲线,(standard curve),标准曲线分析,-,对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释,y=-ax+b,测定荧光定量,PCR,反应的有效性,-,线性的标准曲线：相关系数,R,2,-,扩增效率：,扩增效率,(E)=10,-1/,斜率,-1,标准曲线,分析,荧光定量,PCR,检测方法,Company name,染料标记：,SYBR Green I,探针标记：,水解探针：,TaqMan,非水解探针：,Molecular beacon,Company name,SYBR Green I,工作原理,SYBR Green I,是,一种与双链,DNA,小,沟结合的荧光染料。,SYBR Green I,只,与双链,DNA,结合才能发出荧光。,荧光信号与双链,DNA,分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。,荧光信号强度与反应体系中所有双链,DNA,分子成正比。,5,3,5,3,SG,SG,SG,SG,5,3,5,3,SG,SG,SG,SG,Emission,Excitation,-,变性时，,DNA,双链分开，无荧光信号。,-,延伸结束时，采集荧光信号。,SYBR Green I,工作原理,SYBR Green I,优点：,使用方便，成本低,-,仅需设计两个引物,通用性好,-,对,DNA,模板没有选择性,需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。,缺点：,SYBR Green,与所有双链,DNA,结合,-,引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性,-,只能检测单一模板，无法进行多重检测,Company name,将温度对荧光强度的变化求导。,(-dI/dT),融解曲线,(dissociation curve),确认,PCR,反应产物的特异性,对数图谱,原始图谱,融解曲线分析,-,非特异性产物,-,引物二聚体,Taqman,工作原理,探针与靶序列配对,（一段序列，两个基团，,5,报告基团、,3,淬灭基团）,完整的探针，报告基团,R,发射的荧光被淬灭基团,Q,淬灭，,没有荧光产生。,聚合酶的,5,外切酶活性,报告基团,R,与淬灭基团,Q,分离，发射荧光。,R,Q,Reporter,Quencher,R,Q,荧光信号强度与结合探针的,DNA,分子成正比。,Taqman,工作原理,在退火过程中，探针与靶序列结合,探针被,Taq,酶的,5-3,外切酶活性剪切成片断,游离报告基团发出荧光,在延伸过程中，探针部分与靶序列分离,SYBR Green I,与,Taqman,对比,Taqman,特异性高,-,与特异靶序列结合,对模板有选择性,-,可进行多重,PCR,反应,SYBR Green I,使用方便，成本低,-,仅需设计两个引物,通用性好,-,对,DNA,模板没有选择性,荧光定量,PCR,解析方法,绝对定量,样本中核酸的量（拷贝数、微克）,-,检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有,6000,个拷贝,相对定量,不同样本中目的基因表达量的差异,-,肿瘤组织和正常组织相比,某个基因的表达量,mRNA,改变了多少倍，改变了,60,倍,绝对定量的步骤,拷贝数计算,对标准品进行梯度浓度稀释,荧光定量,PCR,反应,建立标准品,未知样品,Ct,代入标准曲线,确定拷贝数,质粒提取,OD,值测定,计算待测样本浓度,/,样本分子量,/,待测样本拷贝数,标准品进行,5-6,个,梯度稀释,标准品稀释倍数为,10,绝对定量,Sample,-,样本起始浓度与,Ct,呈线性关系，根据已知拷贝的标准品作出标准曲线。,-,根据未知样品的,Ct,值，推算出未知样本量。,以标准品为标杆,相对定量,参照样本,Calibrator,用于比较结果的基准。,35,相对定量,特点,选择内参基因,内参基因,beta-actin、,GAPDH,、,18S rRNA,等,看家基因,housekeeping,gene,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小,-,文献检索,-,实验筛选,内参基因,-,同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。,-RNA,抽提、反转效率不同，操作中存在误差。,对样本初始浓度差异进行均一化校正。,2,-,Ct,法,Company name,成立条件：,假设扩增效率为,100%,满足条件：,1,）内参基因和目标基因的扩增效率接近,2,）内参基因和目标基因的扩增效率均为,90%-110%,假设条件：,内参基因和目标基因扩增效率差异大于,5%,1,）优化实验条件，使扩增效率接近,2,）使用其他方法,相对定量方法,2,-,Ct,法,相对定量举例,相对定量分析,待测样品目的基因 浓度,待测样品内参基因 浓度,F=,对照样品目的基因 浓度,对照样品内参基因 浓度,假设条件：,内参基因和目标基因扩增效率不同,优点：,实验优化简单,缺点：,每一轮实验都必需做标准曲线,双标准曲线法,80%,相对定量举例,双标准曲线法,实 验 流 程,Company name,SYBR Green,法实验流程,Company name,样本处理,RNA,提取,qPCR,数据分析,逆转录,样本处理与,RNA,提取,外界刺激,10min,可检测的表达改变,样品离开定义环境,2min,裂解、固定细胞,TRIzon,（酚、异硫氰酸胍）,裂解液（氰酸胍，异硫氰酸胍，,SDS,）,液氮,RNA,保存液,小心,DNA,污染！,使用,DNase,阴性对照,逆转录,逆转录引物选择,下游应用：是否检测其它基因？,Abundant RNA,的干扰：,mRNA or total RNA,？,检测灵敏度是否足够？,RT-PCR,一步法还是两步法？,两步法,:,反转录和,PCR,扩增分两步进行。,步骤多但灵活多样。,cDNA,可长期保留检测,多个基因。便于反应优化。在,工作的初期。,一步法：,反转录和,PCR,扩增在同一管内完成。,简便、快捷但只做一个基因，一旦失败,难以查找原因。在工作的成熟阶段。,荧光定量,PCR,体系,Template,Primers,DNA,聚合酶,Buffer and,dNTPs,Dye,总原则与普通,PCR,相同：,避免引物二聚体，避免二级结构,扩增片段长度（,80-300bp),推荐做跨,intron,设计,引物设计原则,Master mix,使用,Master mix,有效降低系统误差,-,热启动酶,Hotstar,化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需,10min,Fast Hotstar,抗体修饰，热复活仅需几十秒,-Buffer,反应增强剂,减少模板二级结构影响,控制,Mg,2+,浓度,稳定剂,-Dye,Real SYBRGreen mix,RealSuper mix,Master mix,的优化,新型荧光染料,(Super Green,),激发、发射波长与,SYBR Green,近似,对,PCR,反应抑制更轻微,可使用较高浓度,(1uM,SYBR green 0.3uM),更亮，灵敏度更高,较短的链延长时间,对小片段,DNA,和,ssDNA,结合更弱,减少背景，有效信号更强,与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于,HRM,分析,化学性质更稳定,致突变性与毒性更弱,SYBR Green,Super Green,Master Mix,ROX Passive Reference,不参与、不干扰,PCR,反应,恒定发射荧光信号,用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。,有不同系统，需参照仪器要求选择。,误差控制,使用,Master mix,配置预混体系,设置生物学重复（不同个体）,技术性重复（复孔）,阳性和阴性对照,实验环境控制,试剂准备区,核酸制备区,反应液制备区,荧光定量,PCR,反应区,荧光定量,PCR,体系,数据分析,融解曲线：,单一特异性产物,扩增曲线：,-Ct,值大小,-,各复孔之间重复性,-,不同浓度梯度稀释的间隔性,标准曲线：,-R,2,0.980,或,r,0.990,-,反应效率尽可能高：,90%-110%,-,目的基因的扩增效率接近内参基因,操作注意事项,为避免加样误差，保证重复性，,配制预混体系,配制反应体系时，液体要缓慢加至管底，减少吹打,低速离心，充分混匀，如有气泡短暂离心,不要直接在八连管上进行标记,避光保存，试剂分装避免反复冻融,酒精擦拭移液器的吸头,设置反应重复（至少二个）,设置对照,荧光定量,PCR,仪,ABI 7300 7500 7900,Roche,罗氏,Bio-rad,伯乐,荧光定量,PCR,仪,Agilent,安捷伦,Qiagen Rotor-Gene Q,Corbett Rotor-Gene 6000,案例分析 总体原则,偶然因素,-,操作原因,实验重复,生物学重复、技术性重复,机器因素,仪器加样孔,结合扩增曲线、融解曲线、标准曲线分析,单孔和多孔分析,内参基因和目的基因对比分析,案例分析,扩增曲线,曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显。,扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象。,模板进行梯度稀释时，各浓度间隔性好。,Ct 15-35,重复性,扩增曲线,-,低浓度样本没有稀释好,-,重复性差，加样存在误差,案例分析,扩增曲线,案例分析,扩增曲线,无信号或,Ct,值偏大,内参基因和目的基因均无信号,-RNA,降解,内参基因和目的基因均偏大,-,模板量低,-,对未知浓度的样品应从稀释最高浓度做起,内参基因正常，而目的基因偏大或无信号,-,引物设计,-,目的基因表达量低,案例分析,Q,内参基因与目的基因的,Ct,值之差在多大范围内可以接受？,A,：,-,在使用,2-Ct,法计算的前提是，公式成立的条件是内参基因和目的基因的扩增效率相接近并且足够高，在,90%-110%,之间，因此内参基因与目的基因的差值是可以接受的。,-,内参基因和目的基因的,Ct,值在,15-35,以内，并且重复管之间的重复性很好，这样的数据都是可以接受的。,案例分析,扩增曲线,扩增曲线不平滑,-,样本浓度太低,-,原始信号弱,关闭,ROX,校正信号,案例分析,扩增曲线,扩增曲线很早扬起,-,样本浓度太高,（稀释样品浓度）,案例分析,熔解曲线,熔解曲线出现双峰,引物峰,：,-,阴性对照,（体系污染，配合扩增曲线）,-,降低引物浓度,-,重新设计引物,非特异性扩增,-,基因组污染,-,非特异片段,（重新设计引物）,案例分析,熔解曲线,非正常熔解曲线,-,试剂污染,-,仪器需要校正,各点之间线性关系,各孔的重复性,R,2,相关系数,Slope E,反应效率,案例分析,标准曲线,案例分析,标准曲线,标准曲线的线性关系不佳,-,加样存在误差,-,样品稀释不准确,使得标准曲线不呈梯度。,扩增效率低,（引物的扩增效率、引物与模板的最适比例）,-,调节引物终浓度,案例分析,标准曲线,Trouble shooting,常见问题,可能原因,解决方法,Housekeeping gene,无信号,RNA,降解,用新鲜组织提取,RNA,Housekeeping gene,有信号,而目标基因无信号,1.,目的基因表达低。,逆转录效率不高,2.PCR,引物不良,1.,富集,mRNA,2.,在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。,3.,尝试不同,PCR,引物。减小产物大小，改换目标,区段，考虑不同剪接体。,4.,尝试不同热循程序，降低复性温度。,Housekeeping gene,反应效率正常,但,目标因放大效率不高,PCR,引物不良,重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，,考虑不同剪接体,目标基因表达丰度在,样本之间异常一致,RNA,被基因组,DNA,污染,使用跨,intron,引物,用,DNase,处理,RNA,确保,RNA,阴性对照表现阴性,溶解曲线出现杂峰,出现非特异,PCR,产物,出现引物二聚体,尝试不同,PCR,引物,尝试不同热循程序，升高复性温度,修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与,PCR,特异产物解链温度之间。,阴性对照在,30,个循环,以内出现信号,试剂被污染,注意区分信号是来自引物二聚体还是,PCR,产物,查找，替换污染试剂,使用,UNG,系统。,qPCR,反应优化非关键技术,外包服务,Housekeeping gene,引物序列？反应条件？,目标基因,引物序列？反应条件？,选择试剂，摸索条件，优化参数,两个月？,CoWin,解决方案一：,Primer assay,客户指定：物种，,housekeeping gene,，目标基因,客户得到：经实验优化、验证过的引物，反应条件参数，,MasterMix,客户下游工作：,Real-time PCR,数据获取,CoWin,解决方案二：全套,qPCR,服务,客户指定：物种，,housekeeping gene,，目标基因,客户提供：生物样本,客户得到：数据报告，剩余样品。,客户下游工作：写论文,;,得诺贝尔奖,谢谢！,北京康为世纪生物技术有限公司,总机,010-588519194006-222-360(,免费电话）,订购,010-58851919-618,Order,技术支持,010-58851919-615/616,Support,市场部,010-58851919628,Marketing,