基因工程-第3章-核酸操作的基本技术3.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,杂种核酸分子：,彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。,DNA/DNA的杂交作用，检测特定生物有机体之间的亲源关系。,DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。,核酸杂交常用几种膜的性能比较,硝酸纤维素膜,不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。,应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。,RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。,印迹转移前的凝胶处理：,分子量不同所需转移的时间不同；,浸泡在0.25M的HCL溶液中,脱嘌呤,，再进行,碱变性,碱水解，DNA链断裂,单链,（a）,（b）,（c）,（d）,（e）,基因组DNA,DNA限制片段,硝酸纤维素滤膜,同探针同源杂交的基因DNA片段,X光底片,Southern 凝胶转移杂交技术,Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片,水稻（,Oryza sativa L,.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl,(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同,32,P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。,在进行核酸印迹转移的时，,1.要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤12小时；,2.紫外线交联法，将DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同,尼龙膜,表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。,2、诺赛恩RNA印迹技术,（Northern blotting）,1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做,诺赛恩RNA印迹技术（,Northern blotting）。,而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,，,然后同放射性同位素,125,I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。,3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了,特殊设计的加样装置,，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。,通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上。,4、菌落杂交,也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。,鉴定重组子。,检测重组体克隆的菌落杂交技术,