基因工程的操作.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程基本操作的四个步骤,：,目的基因的,获取,基因表达载体的,构建,将目的基因,导入,受体细胞,目的基因的,检测与鉴定,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,1、编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的,序列。连续的,2、非编码区：,调控遗传信息表达,的核苷酸序列(启动子、,终止子），不编码蛋白质。,（一）、原核细胞的基因结构,（二）、真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,与RNA聚合酶结合位点,1、编码区,（不连续）,2、非编码区：,调控遗传信息表达,的核苷酸序列(启动子、,终止子），不编码蛋白质。,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,一、获取目的基因,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,(1)从基因文库中获取目的基因,什么是基因文库？,什么是部分基因文库？,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,目的基因的有关信息与什么相联系？,概念：,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（如cDNA文库）,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库,基因组文库:,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.,部分基因文库:,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,基因组文库与部分基因文库的关系,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库,将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，这样就构建成了生物的,基因组文库,。这种方法称,直接分离法（或鸟枪法），多用于原核生物。,思考：基因文库如何构建？,如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的,cDNA文库,。这种方法称,反转录法（多用于真核生物）,2)cDNA文库,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据,基因的核苷酸序列,基因的功能基因在染色体上的位置,基因的转录产物mRNA,基因翻译产物蛋白质,等特性。,基因文库的目的：,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的,A、染色体DNA B、线粒体DNA,C、总mRNA D、tRNA,2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是,A、某生物的全套基因就是一个基因文库,B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库,C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库,D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,（2）、利用,PCR技术,扩增目的基因,PCR,聚合酶链式反应,是一项,生物体外复制,特定,DNA,片段的核酸合成,技术,。通过此技术，可获取大量的目的基因。,一、目的基因的获取,、条件,已知基因的核苷酸序列、,四种脱氧核苷酸、,引物、,热稳定,DNA聚合酶（如Taq酶）、,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,、结果：,、方式：,以,指数,方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,2,n,适宜的温度和PH值,、原理：,DNA复制,、过程：,变性、退火、延伸、多次重复四步曲,变性：,加热至,90,95,，,双链,DNA,解链成为单链,DNA,退火：,冷却至,55,60,，,部分引物与模板的单链,DNA,的特定互补部位相配对和结合,延伸：,加热至,70,75,，,在,Taq,酶的作用下，,以目的基因为模板，合成互补的新,DNA,链,变性,退火,延伸,1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是,双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温,A B,C D,D,2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是,A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个,B,反转录法：,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法：,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,反转录,一、目的基因的获取,（3）人工合成法（,真核生物,）,推测,推测,单链DNA,合成,1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是,A、化学合成法 B、基因组文库法,C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应,2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是,从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成,A B C D,A,D,思考：,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,二、基因表达载体的构建核心,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；,（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（4）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,1.基因表达载体的组成：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,2、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。,（2）用_切断目的基因，使其产生_。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组,DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,3.过程:,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,总结：,1.目的基因与运载体结合所需的条件有,同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP,A B,C D,D,1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括,A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是,A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码,B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用,C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选,D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,1、,将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染,双子叶植物,和,祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒,的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞染色DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、,将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,3、,将目的基因导入微生物细胞,常用法,：Ca,2+,处理,常用菌,：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：,繁殖快,、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是,A结构简单、操作方便 B繁殖速度快,C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少,2、基因工程常用的受体细胞有,大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞,A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是,A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合,C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,8.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是,将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养,A B C D,C,(四)目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测,抗原-抗体,杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定,抗病鉴定,活性鉴定等,个体水平的鉴定,返 回,DNA分子杂交技术,归纳:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,技术,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法、,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检测,4）有关基因工程的叙述正确的是 （）,A、限制酶只在获得目的基因时才用,B、重组质粒的形成在细胞内完成,C、质粒都可作为运载体,D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）,A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B、限制性内切酶用于目的基因的获得,C、目的基因须由运载体导入受体细胞,D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,4.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是,检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质,A B C D,C,C,5、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是,A、人工合成目的基因 B、目的基因的检测和表达,C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因与运载体结合,6、（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到,A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接,B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增,C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状,D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,7、下列哪项不属于基因工程技术的步骤,A基因转移 B基因扩增,C基因检测 D基因表达,B,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,