基因工程抗体培训课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,基因工程抗体,*,基因工程抗体,单克隆抗体用于治疗存在的问题,1,、单克隆抗体的特异性,由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严,格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应；,2,、异种抗体反应,鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应,2,基因工程抗体,理想的抗体药物的性质,高特异性和高亲和力（,Kd=10,8,10,10,L/M,）,对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排斥反应,游离抗体不激活补体,一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能,细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行,大规模培养,抗体符合生物制品标准,3,基因工程抗体,问 题,异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果,靶部位摄取的量太低,效应功能弱,在体内被清除速度快,对 策,抗体人源化,改变抗体分子大小,连接毒素、放射性同位素、药物,抗体人源化,抗体治疗存在的问题及对策,4,基因工程抗体,抗体药物改造的方向,抗体人源化和人源抗体制备,改变抗体分子大小,增强抗体亲和力,增强抗体效应功能,5,基因工程抗体,单克隆抗体人源化的改进,鼠抗体人源化（人,-,鼠嵌合、改型抗体）,小分子抗体（,Fab,、单链、单域、超变区多肽）,基因工程抗体（双特异、免疫黏连素、催化抗体）,人源抗体（噬菌体抗体库、转基因小鼠）,人,-,人抗体,6,基因工程抗体,1,、抗体人源化,鼠单克隆抗体人源化：嵌合抗体、改型抗体,小分子抗体：单价,(Fab,、,ScFv,、单域抗体、,超变区多肽,),、多价（,Di,-,Tri-,Minibody,）,特殊类型抗体,(,双特异性抗体、细胞内抗体、,抗原化抗体、免疫脂质体,),抗体融合蛋白（免疫粘连素、免疫毒素、催,化抗体）,7,基因工程抗体,VH,和,VL,是抗原决定簇结合位点,高变区,HVR,决定簇互补区,CDR,骨架区,FR,CH1,和,CL,：,Ig,同种异型的遗传标志,CH2,：补体结合位点,CH3,：,某些细胞,Fc,受体结合部位,8,基因工程抗体,第一代的抗体人源化,嵌合抗体,从杂交瘤细胞分离出,鼠,MAb,功能性可变区基因，与人,Ig,恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人,-,鼠嵌合抗体。,嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的,免疫排斥,反应。,特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,9,基因工程抗体,Pr,鼠,VH,人,CH Pr,鼠,VL,人,CL,免疫球蛋白,基因载体的构建,H,链嵌合载体,L,链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人,-,鼠嵌合抗体基因工程改造策略,10,基因工程抗体,鼠,VH,鼠,V L,人,CL,人,CH,抗体分泌细胞,人,-,鼠嵌合基因工程抗体,11,基因工程抗体,第二代的抗体人源化,改型抗体,在嵌合抗体的基础上进一步将鼠,MAb,可变区中相对保守的,FR(framework region),替换成人的,FR,，保留与抗原结合部位,决定簇互补区,（,complement determinant region),部位,(,即,CDR,移植,),早期的改型抗体：,简单的,CDR,移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。,12,基因工程抗体,第二代改型抗体：,应用了人抗体基因库；,引进计算机技术模拟抗体分子的立体结构,(,分子模拟法,),；,使用了鼠人嵌合,FR,。其目的是获得具有高亲和力的治疗性抗体,13,基因工程抗体,CDR,序列,CDR,序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体,鼠单克隆,V,区人源化（,CDR,移植）,14,基因工程抗体,小分子抗体,人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。,根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体两种。,15,基因工程抗体,单价小分子抗体,一、,Fab,抗体,Fab,段由重链,V,区及,CH1,功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。,Fab,抗体只有完整,IgG,的,1/3,。,16,基因工程抗体,二、单链抗体,(ScFv),定义：,用基因工程方法，,将抗体,VH,和,VL,（,重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成,的小分子抗体，,功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。,Ag,17,基因工程抗体,ScFv,应用,：,用于肿瘤的导向治疗,肿瘤的影像分布,基因治疗,研究基因结构与功能的关系,18,基因工程抗体,三、单域抗体,抗体与抗原的结合主要由,Ig,的,V,区决定，因此只含,V,区基因片段的小分子抗体，即只有,VH,或,VL,一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个,Ig,分子的,1,12,，故也称之为小抗体。,19,基因工程抗体,四,.,超变区多肽,(hypervariable region polypeptides,),抗体抗原结合是经过补体决定区（,CDR,）来实现。因此，,CDR,是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的,CDR,多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个,CDR,多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位,(minimal recognition unit,MRU),。,20,基因工程抗体,多价小分子抗体,在,ScFv,的基础上，可以把两个或两个以上的,ScFv,重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。其中包括双链抗体,(diabody),，微型抗体（,minibody,），三链抗体,(triabody),及四链抗体,(tetrabody),等。,21,基因工程抗体,Ag,Ag,一、双链抗体,(diabody),制备方法,化学交联法,粘性蛋白结构域融合法,接头长度控制法。,22,基因工程抗体,二、三链抗体,(triabody),在制备单链抗体时，当接头的长度为,2,个或,2,个的以下氨基酸残基时，或者直接把,VH,结构域的,N,末端与,VL,结构域的,C,末端相连，通过非共价键而形成的三聚体，称为三链抗体。接头长度在,3,12,个氨基酸残基时，则形成双链抗体。,23,基因工程抗体,三、微型抗体,(minibody,),通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体,(VL-VH),的,VH,结构域与,IgG,的,CH3,结构域融合，形成,VL-VH-CH,3,的结构，称之为微型抗体（,minibody,）。,此种抗体合成后通过,CH3,结构域形成稳定二聚体式，发挥其双价微抗作用。,24,基因工程抗体,四、双特异性抗体（,BfAb,）,天然,Ig,是由两个完全相同的,VL,和,VH,区域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位。而经人工设计构建的双特异性抗体（,BsAb,）则由两个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药物、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体（,bifunctional antibody,BfAb,）,25,基因工程抗体,双特异性抗体的特点,将免疫细胞锚着于肿瘤部位，提高肿瘤部位的效靶比。,不受,MHC,的限制，直接激活免疫细胞的杀瘤机制。,26,基因工程抗体,1,2,3,27,基因工程抗体,提高抗体,效应功能,抗体融合蛋白,双特异性抗体,偶连细胞毒物质,细胞内抗体,提高抗体效应功能,28,基因工程抗体,抗体融合蛋白：,抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。,根据构建方式的不同，主要分为两种形式：,Fc,融合蛋白（,Fc fusion protein,FcFP,）,由抗体的,Fc,段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如,CD4,免疫粘附素，就是由抗体的,Fc,段与,2,个,CD4,分子的,Ig,同源区重组而成,抗原结合融合蛋白（,antigen-Binding fusion protein,ABFP,）,由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。,29,基因工程抗体,免疫粘附素,(immunoadhension),：,将人抗体恒定区,(,主要是,Fc,段,)N-,端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子又被称为新效能抗体。,免疫毒素：,又称生物导弹，是由导向性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。,30,基因工程抗体,偶连细胞毒物质,连接放射性同位素,(,131,I,、,99m,Tc,）,连接植物或细菌毒素（,ricin,、,PE,40,）,连接细胞毒性药物（,C1027,、,柔红霉素）,31,基因工程抗体,免疫毒素,C,C,V,C,V,C,C,C,SPDP,SPDP,Ricin A,Ricin A,（,-FcRI-Ricin A,）,Ricin A:,蓖麻毒素,A,对肿瘤细胞具有毒性作用,32,基因工程抗体,CH1,CH2,CH3,IL-2,scFv,IL-2,免疫细胞因子,(Immunocytokine),33,基因工程抗体,五、细胞内抗体,细胞内抗体主要是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，亦称内抗体（,intrabody,）。,目前的研究主要集中在单链抗体上，在,ScFv,的,C,端或,N,端插入其它靶向信号（,targeting signals,），如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等，从而进行检测、识别、发挥特定功能。,34,基因工程抗体,细胞内抗体的应用：,由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结合特性，因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢。作用机理表现为：,阻断靶蛋白的活性部位,阻断细胞内蛋白蛋白相互作用,干扰细胞内靶蛋白的转运,促使靶蛋白降解,35,基因工程抗体,六、抗原化抗体（,antigenized antibody,Ab,Ag,）,Ab,Ag,是应用基因工程技术，把编码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链,CDR3,序列中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构象和免疫原性的新型抗体。,36,基因工程抗体,今后抗体药物发展的方向,寻找新的靶抗原,基于抗原立体结构设计抗体,基于抗原,-,抗体相互作用设计小分子抗,体模拟物,37,基因工程抗体,最理想的单克隆抗体,100%,人源,人类免疫系统自然产生,38,基因工程抗体,25,年来的全人抗体的尝试,鼠骨髓瘤不适合与人,B,细胞融合,稳定性差,抗体产量低,非洲淋巴细胞瘤病毒,(EBV),保存抗体分泌细胞,细胞株不稳定,抗体的产量低,不能特异性地保存抗体分泌细胞,很难获得人类骨髓瘤细胞株,39,基因工程抗体,成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体进入新的里程,用 途：能稳定的保持人,B,细胞分泌抗体的能力,发明人：英国剑桥大学的,Dr Karpas,教授,意 义：,1,在整体水平上研究人类产生抗体,2,开创人类抗体基因组学的研究,评 价：,1,诺贝尔奖得主,Dr Milstein,推荐发表在,PNAS,2,世界权威杂志,“,科学,”,发表了新闻评述,3,剑桥大学开了新闻发布会,40,基因工程抗体,未来单抗开发的完美方案,从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体,全人抗体挑战靶分子的筛选,开发未知抗原的治疗用抗体,41,基因工程抗体,42,已批准上市的单抗,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,移植排斥,大肠癌,冠心病,淋巴瘤,移植排斥,炎症性肠病、,类风湿,CD3,17-1A,血小板受体,ba,CD20,CD25,TNF-,OKT3,Panorex,ReoPro,Rituxan,Simulect,Remicade,鼠单抗,鼠单抗,人鼠嵌合抗体,人鼠嵌合抗体,人鼠嵌合抗体,人鼠嵌合抗体,1986,1995(,德国,),1994,1997,1998,1998,、,1999,基因工程抗体,43,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,移植排斥,乳腺癌,RVS,感染,AML,CLL,CD25,HER-2,RSV F,蛋白,CD33,CD52,Zanapax,Herceptin,Synagis,Mylotarg,CAMPATH,人源化抗体,人源化抗体,人源化抗体,人源化抗体化疗药物交联物,人源化抗体,1997,1998,1998,2000,2001,基因工程抗体,44,正在进行临床开发中的基因工程抗体,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,银屑病,IL,8,CD11a(IgG1),ICAM-3,CD80,CD2,CD3,ABX,IL8,Anti-CD11a,ICM3,IDEC-114,MEDI-507,Smart anti-CD3,Human(,人源,),Humanized(,人源化,),Humanized,Primatized,Humanized,Humanized(IgG),，,临床前,/,基因工程抗体,45,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,风湿性关节炎,Complement(C5),TNF-,TNF-,TNF-,CD4,CD4,5G1.1,D2E7,CDP870,Infliximab,IDEC-151,MDX-CD4,Humanized,Human,Humanized(Fab),Chimeric(IgG1)(,嵌合,),Primatized(IgG1),Human(IgG),FDA,批准（,1999,）,基因工程抗体,46,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,克罗恩病，节段性回肠炎,溃疡性结肠炎,自身免疫病,TNF-,TNF-,4,7,CD4,CD3,Infliximab,CDP571,LDP,02,OrthoClone OKT4A,Smart anti-CD3,Chimeric(IgG1),Humanized(IgG4),Humanized,Humanized(IgG),Humanized,FDA,批准（,1998,）,/,基因工程抗体,47,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,系统性红斑狼疮,多发性硬化症,C5,CD40L,CD40L,Complement(C5),VLA-4,CD40L,5G1.1,Antova,IDEC-131,5G1.1,MEDI-507,Antegren,IDEC-131,Humanized,Humanized(IgG),Humanized,Humanized(IgG),Humanized(IgG),Humanized,(,继续,),/,基因工程抗体,48,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,自身免疫出血性病症,气喘,/,变态反应,CD64(FcgR),IL-5,IL-5,IL-4,IgE,CD23,MDX-33,SCH55700,SB-240563,SB-240683,rhuMab-E25,IDEC-152,Human,Humanized(IgG4),Humanized,Humanized,Humanized(IgG1),Primmatized,基因工程抗体,49,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,移植物抗宿主疾病,同种异体移植排斥,CD147,CD2,CD2,CD3,CD3,ABX-CBL,BTI-322,MEDI,507,Orthoclone/OKT3,SMAT anti-CD3,Murine(IgM)(,小鼠,),Rat(IgG)(,大鼠,),Humanized,Murine(Ig2a),Humanized,/,FDA,批准（,1996,）,/,基因工程抗体,50,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,同种异体移植排斥,CD25,CD25,2-integrin,CD4,CD147,Zenapax,Simulect,LDP-01,OKT4A,ABX-CBL,Humanized (IgG1),Chimeric(IgG1),Humanized (IgG),Humanized (IgG),Murine(IgM),FDA,批准（,1997,）,FDA,批准（,1998,）,/,基因工程抗体,51,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,同种异体移植排斥,中风,青光眼,抗凝血剂,CD40L,CD18,2-integrin,TGF,2,Fact,Antova,Anti-LFA-1,LDP-01,CAT-152,Corsevin M,Humanized (IgG),Murine F(ab,)2,Humanized (IgG),Human,Chimeric(Fab),/(,继续,),/,基因工程抗体,52,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,冠状血管成形术并发症,心肌梗死,罗氏肉瘤病毒,Glycoprotein ba receptor,PDGF,R,CD18,F protein,ReoPro Abciximab,CDP860,Anti-CD18,Synagis,Humanized(IgG),Humanized F(ab,)2,Humanized F(ab,)2,Humanized(IgG1),/,FDA,批准（,1998,）,基因工程抗体,53,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,艾滋病,乙型肝炎,巨细胞病毒,中毒性休克,一般癌症,Gp120,Hep B,CMV,TNF-,CD14,VEGF,PRO542,Ostavir,Protovir,MAK-195(SEGAND),IC14,Anti-VEGF,CD4 fusion,Human,Human,Murine F(ab,)2,?,Humanized(IgG1),(,批准,),基因工程抗体,54,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,卵巢癌,结肠病,肺病,头、颈部病变,CA125,17-1A Cell surface antigen,Anti-idiotypic GD3epitope,EGFR,OvaRex,Panorex,BEC2,IMC,C225,Murine,Murine(IgG2a),Murine(IgG),MerckKGaA,Chimeric(IgG0,/,德国批准（,1995,）,基因工程抗体,55,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,乳腺病,慢性淋巴细胞白血病,急性粒细胞白血病,非何杰金淋巴瘤,HER2/neu,CD52,CD33,CD20,CD22,Herceptin,Campath1/(LDP03),Smart,Rituxan,LymphoCide,Humanized(IgG1),Humanized,(IgG1),M195,Chimeric,(IgG1),Humanized(IgG),FDA,批准（,1998,）,生物制品许可申请,蛋白质设计,FDA,批准,/,基因工程抗体,56,适用病症,靶抗原,抗体名称,抗体来源,临床阶段,非何杰金淋巴瘤,黑色素瘤,HLA,HLA DR,抗,id(GD2)*,Smart 1D10,Oncolym(Lym-1),TriGem,Humanized,Radiolabelled murine,Murine,/,基因工程抗体,57,武汉生物制品研究所研制的注射用鼠源性抗人,T,淋巴细胞,CD3,抗原单克隆抗体是国内自行研制最早批准上市的抗体；北京百泰生物与古巴合作开发的,I,类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”,(,商品名：泰欣生,),是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物；,基因工程抗体,58,第四军医大学、成都华神联合研制的美妥昔单抗注射液,(,商品名：利卡汀,),是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。,基因工程抗体,噬菌体展示系统,Phage on display,Exponential growth in publications referring to phage display.,The number of Medline citations containing the terms phage,and display are plotted against the year of publication.,TIBTECH NOVEMBER 1999(VOL 17).,Of Needles and Haystacks,59,基因工程抗体,噬菌体展示系统,Phage on display,噬菌体展示原理,噬菌体展示定义、分类,简介噬菌体及淘选过程,噬菌体展示应用,商业化噬菌体展示系统,60,基因工程抗体,表型,基因型,展示肽,编码基因,什么是噬菌体展示,是一项筛选技术，将,外源多肽或蛋白,与噬菌体的衣壳蛋白融合表,达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的,DNA,则位于,病毒粒子内。,使大量多肽与其,DNA,编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分,子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。,61,基因工程抗体,Smith,在,1985,年首次证实外源,DNA,可以插入丝状噬,菌体基因,III,中，并与,pIII,蛋白融合展示。,Smith GP.,Science,1985;228:1315-7,噬菌体展示技术,62,基因工程抗体,63,基因工程抗体,Phage Display Technology,64,基因工程抗体,What can be displayed?,Proteins from 6-300 aa,Short peptides,Antibody fragments,cDNA library,enzymes,65,基因工程抗体,66,基因工程抗体,1,Pan library with,immobilized targets,2,Wash off unbound phage,3,Elute bound phage,4,Amplify overnight,5,Pan eluted phage,6,Isolate individual colony,3-4,2004 Montarop Yamabhai,67,基因工程抗体,Cell Free,展示系统,Display System,Phage Display,Cell Based,Cell Surface Display,Ribosome Display,mRNA Display,68,基因工程抗体,根据噬菌体不同,根据载体不同,根据文库不同,Phage,Library,噬菌体展示系统的分类,Classification of phage display systems,根据载体不同,Vector,True Phage,Phagemid,根据噬菌体不同,Phage,M13,f1,fd,T7,T4,lamda,根据文库不同,Library,随机肽库,cDNA,文库,抗体文库,蛋白质文库,Schematic representation of M13 Phage,Schematic representation of T7 Phage,69,基因工程抗体,种为结构蛋白质。,与展示密切相关的有两种结构蛋,白质。,DNA,在细菌内滚环复制，,细菌不,被裂解,，但生长速度减慢，并且,分泌大量噬菌体颗粒。,M13,噬菌体的组成和结构,Structure of M13 filamentous phage,丝状噬菌体：,M13,、,f1,和,fd,。,单链,DNA,病毒,6407 bp,。,基因组编码,11,种蛋白质，其中,5,Schematic representation of M13 Phage,70,基因工程抗体,Life Cycle of M13,pIII,蛋白结合于,E.Coli,的,F,纤毛,;,细菌的,Tol,蛋白复合体解聚噬,菌体的衣壳蛋白，转运至胞浆,（再用）,;,病毒,ssDNA,进入细菌的胞浆合,成,dsDNA,；,以,dsDNA,为模版合成所有的病,毒蛋白，且通过滚环复制合成,组装病毒所需的,ssDNA,。,第一代噬菌体在感染,10,分钟后出现在培养液中（,37,o,C,）。,感染后,1,小时内平均每个细胞分泌,1000,个噬菌体。,71,基因工程抗体,次要衣壳蛋白,pIII,BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS.VOL 1.NO 2.189203.JULY 2002,406 aa,组成，,5,个拷贝，位于噬菌体的尾部。,由三个功能区组成：,N1,穿膜区：,作用于,E.coli,细胞膜上的,TolA,蛋白；,与噬菌体的入侵有关。,N2,受体结合,区：,负责结合,F,菌毛。,CT,疏水区：,组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌,体组装终止有关。,G1,、,G2:,甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个,功能域之间的灵活性。,Infection of,E.coli,by Ff baceriophage,72,基因工程抗体,主要衣壳蛋白,pVIII,每个病毒子含约,2700,个拷贝，约,10%,能有效地融合外源多肽或蛋白。,以,pIII,融合子方式表达的多肽是低,价的，而以,pVIII,融合子方式表达的,多肽则是高价的（每个病毒子,200,个拷贝）。,这种高价,pVIII,展示所增加的亲和力,有利于筛选到亲和力非常低的配体，,而低价,pIII,展示则将筛选限制在具,有较高亲和力的配体上。,所有,Ph.D.,文库都是,pIII,融合方式,（每个病毒子展示,5,个拷贝的外源多,肽）。,73,基因工程抗体,Smith et al.(1997)Chem.Rev.97,391-410,phagemid vectors,Types of phage display,system,pVIII,展示的多肽比较小，如,果太大会影响噬菌体壳蛋白的,组装。,pIII,只要不影响感染，可以展,示,300 aa,的多肽。,噬菌质粒能展示的蛋白已经达,到,86 kDa,。,74,基因工程抗体,噬菌体质粒,方便克隆、增强遗传稳定性,Phage display with phagemid vectors,噬菌体质粒特征：,携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基,因，没有其他噬菌体基因。,有质粒复制起点,(322 ori),和噬菌体复制,起点,(f1 ori,用于合成,ssDNA),。,有包装序列信号（,packing signal,）。,有供筛选的抗生素标记基因。,Helper phage,：,提供噬菌体质粒复制、合成,ssDNA,和病毒包装所需要的所有蛋白和酶（,f1,ori defect),。,包装后的噬菌体包含有两种不同来源的成份：噬菌体质粒和,Helper phage,。,75,基因工程抗体,多价展示？单价展示？,Polyvalent or monovalent display?,展示价位（,Display valency),：噬,菌体表面展示的多肽的拷贝数。,展示价位不同所筛选的分子亲和力,就会不同。,用噬菌体质粒时，以,pIII,展示为例：,10%,病毒展示为单价，非常少量的,展示为两个拷贝，绝大多数只展示,野生型,pIII,。,The major displaying species,is monovalent,but most,particles do not display at all.,76,基因工程抗体,True phage,Phagemid,多价展示,单价展示,筛选到的分子亲和力相对低,亲和力高,极少或无未展示的噬菌体,*,大 部 分 是 未 展 示 的 噬 菌 体,高拷贝数增加了抗原性,可能会影响噬菌体的组装和增殖,易克隆，遗传稳定性好,77,基因工程抗体,改进,helper phage,78,基因工程抗体,pJuFo,噬菌质粒中加入了,Jun and Fos Leu Zipper,基因,两个基因都以,PelB,作为,signal sequence,，以,lac,作为,promoter/operator,。,NH,2,-pelB+Jun Leu zipper+C-terminal domain pIII-COOH,NH,2,-pelB+Fos Leu zipper+cDNA-product COOH,Jun,和,Fos,通过二硫键形成异源二聚体,the leader in enzyme technology,展示,cDNA,文库,Selection from cDNA libraries,Carmeri et al.Gene 1993,79,基因工程抗体,the leader in enzyme technology,淘选,Finding the needle in the haystack:Screening,phage display libraries,建立,噬菌体展示库,淘选,噬菌体展示库,分析克隆,80,基因工程抗体,the leader in enzyme techn