药物定量分析与分析方法验证(药物分析)课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,中国药科大学药物分析教研室,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,第四章 药物定量分析与分析方法验证,定量分析样品前处理方法,定量分析方法特点,药品质量标准分析方法验证,1,2,3,一、定量分析样品前处理方法,Pretreatment of sample used in quantitative analysis,不经有机破坏的分析方法,概述,：含金属或非金属杂原子有机药物中金属及非金属杂原子(X=卤素、氮、硫、磷)的定量，特别。,1,2,3,经有机破坏的分析方法,泛影酸,碘番酸,碘苯酯,概述,：含金属或非金属杂原子有机药物中金属及非金属杂原子(X=卤素、氮、硫、磷)的定量，特别。,概 述,磺溴酞钠,三氯叔丁醇,酒石酸锑钾,富马酸亚铁,概 述,第一节,概 述,含金属有机药物,卡巴胂,金属有机药物,直接测定法含金属或C-M不牢固的有机金属,配位滴定：葡萄糖酸锌、钙,氧化还原：富马酸亚铁,经水解后测定法不稳定碳-卤键化合物,碱化回流后测定：三氯叔丁醇,经氧化还原分解后测定法卤素联芳环牢固（一般用于测碘）,碱性还原后测定法如泛影酸、碘番酸：NaOH-Zn粉-加热,利用药物中可,游离,的金属离子的氧化性测定含量,不经有机破坏,的分析方法:,经有机破坏,的分析方法,湿法破坏:硫、氮含量测定,HNO,3,-HClO,4,、H,2,O 硫、硒含量测定,HNO,3,-H,2,SO,4,H,2,SO,4,-CuSO,4,凯氏定氮,（kjeldahl nitrogen det.）,干法破坏,：无水碳酸钠或氧化镁，注意温度,砷盐测定。,氧瓶燃烧,法：非金属杂原子通用分解法,卤素、硫、磷等,凯氏定氮法（kjeldahl nitrogen determination）,仪器装置,凯氏烧瓶：,为3050ml（半微量法）或500ml（常量法）硅玻璃或硼玻璃制成的硬质茄形烧瓶,蒸馏装置,（半微量法）,：,1000ml的圆底烧瓶（A）、,安全瓶（B）、,连有氮气球的蒸馏器,（C）、,漏斗（D）、,直形冷凝管（E）、,100ml锥形瓶（F）,橡皮管夹（G、H）,空心,A.燃烧瓶 B.铂丝网 C.D.盛固体样品滤纸及其折叠法 E.F.G.称取液体样品方法,7mm,50mm,30mm,尾部,7mm,13mm,20mm,356mm,16,6mm,滤纸,滤纸,A,F,E,D,液体样,C,B,固体样,氧瓶燃烧装置及称样方法,25mm,氧瓶燃烧法,样品,吸收液,测定方法,含,氟,有机药物,H,2,O,pH4.3 HAc-NaAc,Buffer 茜素氟蓝,分光光度法,含,氯,有机药物,NaOH溶液,银量法,含,溴,有机药物,H,2,O-NaOH,银量法 分光法,NaOH-SO,2,含,碘,有机药物 间接,NaOH,碘量法（硫代硫酸钠）,直接,NaOH-SO,2,银量法,碘苯酯含量测定,取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用,NaOH,T.S.2ml与H,2,O 10ml为吸收液，待吸收完全后，加,溴醋酸,溶液10 ml，密塞，振摇放置数分钟，加,甲酸,约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min，以除去剩余的溴蒸气，加,KI,2g，密塞，摇匀，用Na,2,S,2,O,3,液(,0.02mol/L,)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠液(0.02mol/L)相当于,1.388mg,的C,19,H,29,IO,2,第二节、,定量分析方法的特点,容量分析法,简便、耐用、精密,相对误差,99.5%,。,滴定度（,T,）,:,每,1 ml,规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量。,光谱分析法,UV,定量：朗伯,-,比耳定律,线性范围,仪器与校正、溶剂要求,测定法：对照品对照、吸收系数、计算分光光度、比色。,色谱分析法,系统多样、测定专属,系统适应性试验：柱、流动相、分离度、重复性、脱尾因子,测定法：外标、内标、替代对照,第三节 药品质量标准分析方法验证,目的：,证明所采用的分析方法适合于相应的检验要求,效能指标：,评价分析方法的尺度,效能指标包括:,精密度、准确度、专属性、检测限、定量限、线性与范围、耐用性,药品质量标准,分析方法验证,药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验,指导原则,药物稳定性试验,指导原则,缓释、控释制剂,指导原则,微囊、微球与脂质体制剂,指导原则,细菌内毒素检查法应用,指导原则,不同分析测定方法的要求,(1)准确度,（accuracy）：,测量值与真实值接近的程度,表 示:回收率,测定方法：回收试验,加样回收试验,(2),精密度,（precision）：,定 义:,同一样品多次测量值之间相互接近的程度,表 示：,标准偏差(s),相对标准偏差(RSD),重复性:,同一实验室,同一人多次测定的精密度,中间精密度:,同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度,重现性:,不同实验室，不同人测定的精密度,(3)专属性,（specificity）:,指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性)。,(4),检测限,（limit of detection，LOD）：,药物能被检出的最低浓度(g/ml),测 定:信噪比法,(S:N=3:1),(5),定量限,（1imit of quantitation，LOQ）：,药物能被定量测出的最低浓度(g/ml),测 定:信噪比法,(S:N=10:1),药品质量标准分析方法验证,-,性能指标,药品质量标准分析方法验证,-,性能指标,(6),线性与范围,（linearity and range）：,待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围,线性关系：Y=a+bx （r0.998),线性程度：相关系数,因方法、对象或要求而异,HPLC法：高低范围约200倍以内,常同时用于：含量测定与有关物质检查,UV法：高低范围约10倍以内,用于：含量测定与溶出度或释放度检查,体内药物浓度测定：高低范围可达2000倍以上,由于浓度跨度大，,常用曲线回归，或权重回归,(7),耐用性,（robustness）:,测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度。,色谱法：流动相的组成和pH、商品柱的品牌尺寸、柱温等。,容量滴定法：溶剂的体积、供试品的取样量、,指示剂的加入量、温度、滴定液的浓度，等。,比色法：供试品用量、试剂的浓度与用量、操作的平行性、,显色剂的浓度与用量、显色反应条件，等。,取本品约0.20g，精密称定，加冰醋酸40ml超声溶解，放冷，加醋酐1ml，结晶紫1滴，用高氯酸滴定液（0.1 mol/L）滴定至绿色，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于29.22mg的C12H8 F3N2O2Na。,分别取供试品0.15g,0.20g,0.25g各三份测定。,非水滴定,含量测定,：,空白试验结果：0.03ml,高氯酸滴定液：0.1034 mol/L,取样量的80%120%范围内，含量测定结果良好。,检验项目和验证内容：,项目内容,鉴别,杂质测定,含量测定及溶出量测定,定量,限度,准确度,精密度,重复性,中间精密度,专属性,检测限,定量限,线性,范围,耐用性,已有重现性验证，不需验证中间精密度,如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充,视具体情况予以验证,色谱法分析测定时系统适用性试验,A.R1=CH2-CH2-CH3,R2=R4=H,R3=OH(lincomycin)B.R1=R3=H,R2=C2H5,R4=Cl(clindamycin B)C.R1=CH2-CH2-CH3,R2=R4=H,R3=Cl(7-epiclindamycin).,克林霉素,Clindamycin Hydrochloride,杂质Impurities：,BP,stationary phase:octadecylsilyl silica gel for chromatography R,Mobile phase,:Mix 45 volumes of,acetonitrile R,and 55 volumes of a 6.8 g/l solution of,potassium dihydrogen phosphate R,adjusted to pH 7.5 with a 250 g/l solution of,potassium hydroxide R,.,Ref Sol a:clindamycin hydrochloride CRS,in the mobile phase 1mg/mL.,System suitability:relative retentions,with reference to clindamycin(retention time=about 10 min):impurity A=about 0.4;impurity B=about 0.65;impurity C=about 0.8.,ChP,【含量测定】照高效液相色谱法测定。,色谱条件与系统适用性试验,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢铵溶液(取磷酸二氢铵2.88g，加水溶解并稀释成1000ml，用80磷酸溶液调节pH值至3.0)-甲醇(210300)为流动相；检测波长为214nm。,理论板数按克林霉素峰计算应不低于1300。,USP29:,Chromatograph the Standard preparation,and record the peak responses as directed for Procedure:,the resolution,R,between the clindamycin B peak and the 7-epiclindamycin peak is not less than 2.4;the resolution,R,between the 7-epiclindamycin peak and the clindamycin peak is not less than 3.0;the column efficiency calculated from the clindamycin peak is not less than 4000;the tailing factor for the clindamycin peak is not more than 1.2;and the relative standard deviation for the clindamycin peak is not more than 1.0%.,系统适用性试验目的：确认规定的已经进行过验证的条件下，,分离度和精密度是否符合测定要求。,其他一般应该自然满足。,第四节 生物样品分析的基本要求,1、生物样品的种类,血浆、尿液、组织、,2.生物样品的前处理,除蛋白（变性）：如应用三氯醋酸、HClO,4,、有机溶剂(乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀、金属盐、酶消化法,缀合物分解：酸水解、酶水解,(3)分离-纯化-浓集：LLE，SPE，Column Switching,(4)衍生化：改变色谱分离行为、提高灵敏度、提高稳定性,3、定量分析方法要求与验证,定量分析方法的验证,-,生物样品分析,（一）特异性,内源性物质不得干扰原药、代谢物,（二）标准曲线,r0.997，至少5个浓度，不许外延,（三）精密度和准确度,RSD15、20,相对回收率85115（80120）,（四）最低定量限LOQ,35倍t,1/2,，或1/101/20倍C,max,（五）样品稳定性,室温、冻融、冰冻长期,（六）提取回收率（绝对回收率）,一般低于100，须稳定,（七）质控样品,已知浓度样品分批插入待测生物样品分析序列中，以确保定量测定的准确度,定量分析方法的验证,-,生物样品分析,血浆样品测定典型示例：,青霉素V 钾,SRM 检测的离子反应,青霉素V 钾:,m/z,351.1 159.9,青霉素钠,m/z:,335.1 175.9,HPLC-UV法,色谱柱Discovery R RP Amide C16,5m粒径（150 mm 4.6 mm ID）;固定进样环50L；,流动相为乙腈-0.01 mol/L CH3COONa为25:75(V:V),流速0.8 mL/min;紫外检测波长为210nm,