海洋生物技术之生物活性物质.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,海洋生物活性物质,一、概论,二、海洋生物活性物质结构类型,三、海洋生物活性物质研究领域,四、海洋药物开发的成功案例,海洋植物活性物质研究,一、红树林植物,二、大型海藻,红树植物,红树植物（mangrove plant）是一类生长在热带海洋潮间带的木本植物。例如，红树、秋茄树、红茄冬、海莲和木榄等。当退潮以后，红树植物在海边形成一片绿油油的,“,海上林地,”。,全世界红树植物种类有24科、30属、83种（或变种），我国发现的真红树植物有12科、15属、26种，半红树植物有9科、10属、11种，分布在海南、广东、广西、福建和台湾等省沿海，以及香港和澳门地区。,红树植物种类和分布,在十五期间，对红树林植物化学成分进行了系统而又深入的研究。北京大学、中科院上海药物所、中科院南海海洋研究所,20世纪6070年代开展了广泛的中草药资源调查，在此基础上形成的全国中草药汇编（1978年），收录了3种红树林植物：老鼠簕、海芒果和黄槿，描述了其民间药用价值。但红树林植物药至今仍不属于正统的中药体系，无论是以前版的还是最新2000年版的中华人民共和国药典，在其中药部分，都没有正式列入任何红树林植物药，可见到目前为止，中国红树林药物只限于民间利用，对它的研究开发基本上仍属于空白。,红树植物药用价值,植物用多酚类化合物保护自己就是一个典型例子。,植物受机械伤害或病原微生物侵害以后，植物的多酚类化合物则产生氧化还原反应，形成有毒性的物质，抵抗机械伤害或病原微生物侵害。,海 藻,褐藻：海带、裙带菜、鹿角菜、绳藻,红藻：紫菜、石花菜,海藻活性多糖,海藻活性氨基酸和多肽,海藻活性脂类,海藻活性萜类,海藻活性酚类,海藻的其他活性物质,海藻活性物质,目 录,一、微藻生物活性物质种类,二、微藻生物活性物质分离纯化技术,三、微藻生物活性物质应用,四、存在问题分析,五、展望,一、微藻活性物质种类,微藻活性多糖,微藻活性脂类,其它活性物质,微藻活性蛋白,微藻毒素类,微藻酶类,微藻抗生素类,微藻色素,利用微藻开发生产生物活性物质的优点：,微藻种类繁多，活性物质新颖、独特；,微藻生长快、产量高、适应能力强；,可定向培养、易调控。,二、微藻活性物质分离纯化技术,要获得微藻的胞内产物，细胞破碎是必须经历的一个步骤。破碎的方法包括高压搅拌，球磨，反复冻融和超声波等。,萃取：利用有机溶剂萃取胞内活性物质已经被广泛地应用于微藻活性物质的提取，如虾青素，,-,胡萝卜素。,从天然藻粉或藻泥中萃取出来的粗提物可以利用高速逆流层析、超临界流体层析、高效液相色谱、反相层析，硅胶吸附层析，凝胶吸附层析等多种层析手段进行纯化。,（1）微藻活性多糖,紫球藻多糖（抗菌）、繁枝蜈蚣藻多糖（抗氧化）、圆型脐叶藻多糖（抗凝血活性）、匍扇藻多糖（抗病毒）、扁藻多糖（抗肿瘤）、盐藻多糖（抗菌、抗炎）、紫球藻多糖（抗氧化）等。,由于在高温、脱水、冷冻等情况下具有独特的稳定性，决定其不仅可用作食品、医药、化妆品、纺织、印染、冶金、石油等行业的黏合剂、乳化剂和增稠剂，还可用于医用生物制品的干燥和保存，如血液制品、菌苗、疫苗、单克隆抗体、载药脂质体、抗血清等。,作者,功能,引用次数,发表年份,Lobner M,Walsted A,Larsen R,Gloaguen V,Morvan H,Hoffmann L,Balachandran P,Pugh ND,Ma GY,Grzanna R,Polotsky A,Phan PV,Kaji T,Fujiwara Y,Hamada CKaji T,Fujiwara Y,Inomata Y.,Hirahashi T,Matsumoto M,Hazeki KZhang HQ,Lin AP,Sun Y,Pugh N,Ross SA,ElSohly HN,Lee JB,Srisomporn P,Hayashi K,Mishima T,Murata J,Toyoshima M,加强免疫,细胞毒性,加强免疫,加强免疫,抑制内皮细胞增殖,抑制内皮细胞增殖,加强免疫,加强免疫,加强免疫,抗单纯疱疹病毒,抗肿瘤,3,0,3,1,10,11,27,6,33,9,45,2008.06,2007.10,2006.12,2006.06,2002.06,2002.03,2002.03,2001.12,2001.11,2001.01,1998.08,PSP的国内外研究情况,螺旋藻多糖（Polysaccharide from Spirulina platensis，PSP）,微藻中多糖提取方法的比较,水提法,称取一定量湿藻体加蒸馏水，沸水浴加热13h定容，滤纸过滤，滤液稀释一定倍数，蒽酮法测糖。与提取时间有关，需要长时间加热提取。,碱提法,称取一定量的湿藻体，加入不同浓度的碱液，其余步骤与水提法相同。优缺点同水提法，不利于藻体综合利用。,冻融水提法,称取一定量的湿藻体，加蒸馏水，反复冻融三次，离心。藻体碎片加一定量的蒸馏水，沸水浴加热3h滤纸过滤，得滤液；收集冻融上清液，定容。滤液、上清液用蒽酮法测糖。,微波法,藻粉先进行微波提取，提取液离心再加3倍无水乙醇沉淀，静置12h后离心，沉淀加3%TCA溶解，离心获得上清液，再通过无水乙醇沉淀，对沉淀进行无水乙醇洗涤，真空干燥，得到粗多糖。辅助提取技术。,TCA(,三氯乙酸)法,离心收集藻细胞，60恒温，干燥，置4%氢氧化钠溶液中，反复冻融3次，离心，分别收集上清液与藻体碎片，藻体碎片置沸水浴中加热3h，滤纸过滤得滤液，合并滤液与上清液，水浴浓缩，往上述收集的浓缩液中分别加入3倍体积的无水乙醇沉淀上清液，离心，取沉淀物，用3%三氯乙酸溶解沉淀，离心，取上清液，用无水乙醇沉淀，重复上述操作二次除去蛋白，最后收集的沉淀物即为多糖提取物。,酶法,对微藻细胞，先进行水提，然后用胰蛋白酶水解，再用木瓜蛋白酶水解。粗多糖经脱蛋白、脱色和去除小分子杂质，得到较纯的多糖混合物，再经柱层析纯化分级，得到精制的单一多糖。多糖的得率提高。,选择冻融法对微藻进行提取，再运用TCA法除去提取液中的蛋白质，可以得到较高得率的多糖粗提物，该方法简便易行，具有良好的可操作性。,粗多糖纯化可用离子交换层析、凝胶过滤、透析等方法可取得较好纯化效果。,微藻多糖的提取及分离纯化,（2）微藻活性脂类,微藻的脂肪酸组成成为研究热点，主要原因有：,微藻是许多长链多元不饱和脂肪酸,（,polyunsaturated fatty acids,，,PUFAs,）的重要来源；,PUFAs,具有营养学和医药学价值；,脂肪酸组成和海藻系统分类之间存在着很大的相关性。,PUFAs的生物活性,不饱和脂肪酸(PUFA)对人体具有重要的平衡调节作用，其中EPA具有降血脂和抗动脉粥样硬化、抗肿瘤和免疫调节等方面的作用，DHA具有调节中枢神经系统功能。因此PUFA可以预防和治疗心血管疾病、中枢神经系统疾病，提高人体的免疫机能调节、抗衰老、提高记忆功能。,最引人注目的是硫代6脱氧葡萄糖甘基二酰甘油(SQDG)，可以抑制HIV的复制，是一种新型抗HIV药物，美国国家癌症研究所已经选择用该种酯作为进一步治疗艾滋病的主要药物。,EPA和DHA具有预防心血管病和类风湿性关节的作用，对婴幼儿营养亦是必需的。,目前，PUFA的提取主要有低温冷冻结晶法、尿素包合法、吸附分离法、分子蒸馏法、脂肪酶提取法、膜分离法以及二氧化碳超临界萃取法等。而微藻中PUFA的提取主要是利用溶剂法、超临界萃取以及尿素包合等方法。,微藻中PUFAs的提取方法,项目,鱼油,微藻,PUFAs含量,鱼腥味,胆固醇,PUFAs,繁殖周期,价格,低,有,高,复杂,长,贵,较高,没有，可做食品添加剂,没有，可做药用,单纯，相对易提纯,短，受环境影响小,相对便宜,传统工业鱼油与微藻中PUFAs的比较,微藻,AA,EPA,DHA,金藻（Olistho discussp）,卡氏前沟藻（Amphi diniumcarterii）,隐藻(Unknown cryptomonad),紫球藻(Porphyridium cruentum),三角褐紫藻(Phaeoaoct tricornatum),中肋骨条藻(Skeletonema costatum),神秘小球藻(Cyclotella cryptica),淡水海链藻(Thslassiosira fluviatilis),圆形薄钙板藻(Syracosphaera caoterae),单鞭金藻(Monochrysis lutheri),黄藻（Chromophyta）,眼点拟微绿球藻（,Nannochloropsis oculata,）,黄绿等鞭金藻(Isochrysis galbana),1.2,24.3,0.2,0.5,0.1,1.3,6.1,4.8,21.8,7.4,13.8,20.3,8.6,13.8,7.5,8,3.9,16.3,53.2,24.4,3,25.4,0.7,0.8,1.7,0.9,2.2,8.6,13.1,8.9,19.3,某些微藻中的PUFAs分布（%）,各种油脂提取方法的比较,方法,藻类,提取物中脂肪酸的含量%,提取率%,EPA,DHA,EPA,DHA,超临界提取法,小球藻,20.98,41.35,92.1,89.4,索氏提取法,11.83,20.59,75.7,65.7,乙醇乙烷法,13.75,29.70,69.6,75.0,超声法,16.67,27.60,87.2,73.1,氯仿甲醇法,三角褐指藻,18.86,3.14,乙醚石油醚法,12.55,2.35,丙酮,日本小球藻,20.0%,各种油脂提取方法的比较,溶剂法提取微藻中油脂具有操作简单、便于实施的特点。不同的溶剂提取得到的油脂种类、得率也不相同。但用到的大多数有机溶剂具有毒性，难以回收。且该法自动化程度低，操作重现性也不尽如人意。,尿素包合法的影响因素较多，且尿素的浓度过高形成晶体析出时，会带出一部分不饱和脂肪酸，导致其丢失。,利用超声波强化溶剂提取过程，可缩短提取时间、提高溶剂利用率而减少溶剂用量、提高提取率。设备简便易得。但操作过程中会产生噪音污染。,各种油脂提取方法的比较,脂肪酶提取方法具有条件温和，对环境友好的特点。但提取所需时间过长。一般需要十几个小时。,超临界提取法具有快速、高效的特点。普通溶剂法需数小时方能完成萃取过程，用SFE法只需约lh即可完成。溶剂法蒸干溶剂后所得的产物为棕色到绿色的油状物，具腥臭味。SFE法产物则具海藻香味。残藻性状溶剂法提取藻类后残藻色泽暗淡，失去原海藻的香味。直接酯化法提取藻类后残藻则呈泥状。超临界萃取CO2藻类后藻粉仍呈干燥的粉状，外观与萃取前无异状，藻香依旧，仍可用作其他目标的提取原料（如提取螺旋藻的藻蓝蛋白等）或用作饲料。此外，由于SFE法通过对工艺条件的控制，可调节超临界CO2对微藻所含物质的溶解能力，因而对被萃取物有一定的选择性萃取能力，其产物中EPA和DHA的含量都高于其他溶剂法。,（3）微藻活性蛋白,藻胆蛋白(Phycobiliproteins，PBP)分成三类：,藻红蛋白,(,Phycoerythrins,，,PE),。主要存在红藻中，藻红素主要吸收绿光，其吸收峰约在,565nm,，故显红色。,藻蓝蛋白,(,Phycocyanins,，,PC),。主要存在蓝藻中，藻蓝素主要吸收橙黄光，其吸收峰约在,620nm,，故显蓝色。,别藻蓝蛋白,(,Allophycocyanins,，,APC),。其吸收峰约在,650nm,。,藻胆蛋白的国内外研究情况,（4）微藻色素,微藻细胞内色素的种类和含量因藻种的不同和环境条件的不同而有所不同，但主要含有四种基本色素，即叶绿素、叶黄素、胡萝卜素和藻胆素（藻蓝素和藻红素），其中以叶绿素含量最多，大约为细胞干重量的,1%,6%,；有的微藻还含有其他色素，如血球素（,Haemato,codduspluvialis,）中虾青素含量特别多。,在微藻合成的色素中,-,胡萝卜素、虾青素和叶黄素是最具有开发价值的三种色素。,各种提取-胡萝卜素方法得率的比较,提取方法,微藻种类,得率（%）,柱层析法,杜氏藻,11,超声法提取,溶剂萃取法,螺旋藻,0.675,微波法,0.0833,-胡萝卜素提取方法的比较,柱层析和溶剂萃取法是传统的提取方法，二者提取过程大体相同，区别在于纯化过程。溶剂萃取法所用萃取溶剂多为有机溶剂，具有毒性并且难以回收。柱层析法用乙醚-石油醚作为洗脱剂，其毒性较小，易于操作和工业化且产品纯度相对较高。微波提取和超声提取为较新的提取方法。微波提取具有高效、得率高的特点。但目前无法进行大规模工业化生产。而超声提取在操作过程中会产生一定的噪音污染。,各种提取虾青素方法得率的比较（雨生红球藻）,提取方法,得率(%),直接研磨法,1.50,低温研磨法,3.20,匀浆法,0.76,冻融温差法,0.93,超声法,0.96,微波法,1.02,化学破壁法,0.63,微藻中叶黄素的提取,用万寿菊花生产叶黄素已实现产业化，其叶黄素的分离提取工艺已经成熟。但从微藻中分离提取叶黄素目前还处于实验室阶段，研究对象主要集中在从小球藻中提取叶黄素上，关于从其它微藻中分离提取叶黄素的研究尚未见文献报道。,目前从微藻中提取叶黄素的方法还不成熟，中试规模的分离提取也未见报道。究其原因可能是由以下几方面造成的：（1）微藻的高密度大规模培养技术缺乏。很多具有相关分离提取技术的研究单位，缺乏微藻大规模培养的经验，因此无法获得足够的微藻原料；（2）微藻细胞中叶黄素含量和微藻培养合成叶黄素的产率较低，因此没有提取价值；（3）微藻细胞壁厚，分离提取存在一定困难；（4）微藻培养及叶黄素分离提取成本太高。因此如何有效地解决上述问题，是今后利用微藻培养法生产叶黄素的关键所在。,（5）微藻抗生素类,许多微藻能产生对其它微藻、病毒、细菌、真菌和原生动物有毒性作用的抗微生物化合物。这些化合物大多为有机酸、脂肪酸、溴酚及其它酚类抑制剂、丹宁、类萜，多糖及醇类等。,（6）微藻毒素类,海洋微藻尤其是双鞭甲藻和蓝藻，能产生各种毒素，这些毒素很有希望开发成为有用的医药产品。,由于微藻毒素大多数是以对生物神经系统或心血管系统的高特异性作用为基础的，所以利用这些毒素及作用机制是开发神经系统或心血管系统的重要导向化合物，其在医学上的应用正在研究之中。,（7）微藻酶类,目前关于胞外酶的研究主要集中在细菌、真菌方面，藻类胞外酶研究得较少，相关报道不多。近来，已陆续报道出多种微藻胞外酶，如胞外碳酸酐酶、胞外氨基酸氧化酶等。,碳酸酐酶（,Carbonic,anhydrase,，,CA,）是一含,Zn,的金属酶，可催化,HCO3,与,CO2,的相互转化。,（8）其他微藻活性物质,能够产生大环内酯类化合物的微藻主要是前沟藻。本类化合物以其独特的大环内酯结构和显著的抗肿瘤活性而引起国际上众多学者的关注。,如利用海洋微藻细胞的螯合同化作用，可把硒、锗、锌等对人体有益的无机微量元素转化成细胞内的有机螯合物，当无机形式转化为有机形式后，能使这些微量元素具有普遍的食用和保健价值。,1989,年,Gustafason,从人工培养的鞘丝藻,(,Lyngbya,laterheimii,),细胞提取物中分离出硫代,-6-,脱氧葡萄糖甘基二酰甘油,(SQDG),，它可以抑制,HIV,的复制，是一种新型抗,HIV,药物。,三、微藻活性物质应用,营养,医药,美容,环保,微藻,四、存在问题分析,（,1,）活性物质筛选等基础性工作薄弱,（,2,）活性物质的分离纯化等技术相对落后,（,3,）利用基因工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术手段进行微藻生物活性物质开发更是刚刚起步,（,4,）产业化水平低,投入不足,五、展望,微藻资源丰富，含许多化学结构新颖、具有特殊生理功能的生物活性物质。而微藻藻种的定向改良、培养条件的优化、分离提纯工艺的改进、微藻转基因工程等现代生物技术提高了微藻的产品价值和产业效益。,众所周知，人类正面临人口膨胀、陆地资源减少和环境恶化这三大全球性问题。微藻资源的开发与应用为人类解决这些问题提供了一条全新而有效的模式。,海洋微藻研究展望,微藻还存有许多丰富的、结构独特、作用各异的初级或次级代谢产物，具有多种多样的生理活性，这些活性物质主要包括几大类：抗生素，包括具有抗细菌、真菌的物质；心脑血管活性物质；抗肿瘤、抗艾滋病等的活性物质；动物生长促进剂(SGF)和植物生长调节剂(PGR)等，是今后海洋微藻研究开发的主要方向。,这些活性物质在,现代生物工程,、,基因工程,和,遗传工程,、,药物研制,等高新技术领域占有重要位置。,应用现代高新技术,对海洋微藻进行全方位的研究开发，挖掘海洋微藻的应用潜力。,谢 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