第二讲-体外受精课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章：动物配子与,胚胎生物工程,第一讲：体外受精技术,一概述,二卵母细胞的体外成熟,三卵子和精子的体外受精,四早期胚胎的体外培养,五影响体外受精的因素,六应用前景,一、概述,（一）定义,从狭义上讲，体外受精,（,in vitro fertilization）,是指将动物受精过程中的精卵结合在体外环境下完成的一种现象，包括自然条件下的体外受精（两栖类和鱼类的正常生殖过程）和人为培养条件下的体外受精（哺乳动物）。,哺乳动物的体外受精,实质将精子和卵子分别从公、母畜体内取出并经过一系列的处理，使精卵在体外条件下结合的过程。,体外受精的主要内容包括：,1）卵母细胞的体外成熟,(,in vitro maturation,IVM),2）,卵子精子体外受精(,in vitro fertilization,IVF)；,3）,受精卵的体外培养(,in vitro culture,IVC)。,体外受精程序,(二)体外受精的意义,一、提高动物繁殖力的有效措施(精卵),二、体外受精可为胚胎移植提供充足而廉价的胚胎,为工厂化生产胚胎提供可能,三、为其他动物繁殖生物技术，如动物克隆、动物转基因工程和胚胎干细胞等研究提供丰富的试验材料和必要的研究手段,四、有利于揭示受精的本质和机理，并有助于研究胚胎的分化和发育。,（三）研究历史,体外受精是在20世纪80年代初研究成功,并在近10年得到逐步完善的一项配子与胚胎生物技术,1959年，张明觉利用获能处理的家兔精子进行体外受精实验，获得了世界上第一批体外受精的试管小兔;,1982,年，美国学者,Brackett,等成功报道世界首例体内成熟的卵母细胞经体外受精获得试管牛；体外成熟卵母细胞和完全体外化的试管牛也分别于1986年和1988年报道成功。目前,一套高效的牛胚胎体外生产程序已经建立起来,并逐步进入生产推广的产业化阶段。我国体外受精技术的研究起步于80年代后期，但进展很快，已先后在人和牛等8种动物取得成功。特别是人和牛的体外受精技术已达到国际先进水平，每年约有近千例试管婴儿诞生。,（二）卵母细胞的体外成熟,1培养液,用于卵母细胞体外成熟的基础培养液有,TCM199，Hams F-10，Menezos B2，NUSC23,和,MEM,等，其中应用最广泛的是,TCM199。,这些基础培养液上需添加一定浓度的血清（510%的,FCS,或,ECS）,和促性腺激素等成分。激素对卵母细胞体外成熟的作用不确定：在有血清存在的条件下，激素对卵母细胞体外成熟的作用不大，浓度过高反而有一定的副作用；但在无血清存在的条件下，激素则对卵母细胞的受精能力和胚胎发育能力均有一定促进作用。,2培养时间,对大多数家畜来讲，卵母细胞的成熟培养时间一般采用2224小时，但猪多采用4044小时，马多采用3036小时。时间过短，虽然卵母细胞已达核成熟，但细胞质尚未充分成熟；而培养时间过长，势必因卵母细胞的代谢底物不足而影响其活力，最终导致受精率和胚胎发育率下降。,3温度和气相,人和啮齿类动物的卵母细胞体外成熟采用37，牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞成熟培养温度均采用3839。研究表明，牛卵母细胞在38.5培养16小时后再在37培养8小时可以提高其分裂率和囊胚发育率。,由于目前采用的培养液大都以,HCO,3,-,作为酸碱缓冲体系，故需维持一定浓度,CO,2,的气相环境来保持培养液的酸碱度，否则会因为培养液中,CO,2,的逸出而使培养液的,pH,升高，一般采用5%的,CO,2,。,4培养系统,卵母细胞的成熟培养系统大致可分为：,（1）开放培养系统,将12,ml,成熟培养液直接置于平皿内或五孔培养板内，然后放入50200枚卵母细胞进行培养，上面不盖石蜡油。该系统的优点是简单，对培养液中的脂溶性物质没有影响，且同时能培养大量的卵母细胞；缺点是渗透压的变化较大，容易污染，故培养液的量和培养向内的湿度要特别注意。该系统根据平皿的运动状态分为静止培养系统和摇动培养系统两种，如采用静止培养系统时应在成熟培养液中加入一定浓度的,FSH(0.1ug/ml),否则会因卵母细胞的严重贴壁而使卵母细胞变形。,（2）微滴培养系统,将成熟培养液先在组织培养皿中做成50500,ul,的微滴，上覆石蜡油，然后将卵母细胞置于其中培养。该系统的优点是成熟培养液中的渗透压比较稳定，且不易污染；缺点是对培养液中的脂溶性物质有稀释作用，且成本较高，培养结果易受石蜡油影响。此法适用于多组对比实验，或来源于不同母畜的卵母细胞的分别培养等。,（3）密闭培养系统,将卵母细胞置于含有12,ml,成熟培养液的试管中，加盖胶塞，然后在培养箱或恒温水浴中培养；如若采用培养皿或微滴培养，则可将其装入一个密闭的塑料袋中。该法的优点是不需要,CO,2,培养箱，方便运输；缺点是,pH,不如前者稳定。,三卵子和精子的体外受精,（一）精子的制备,精液中含有大量的精浆和精子获能的抑制因子，在体外受精前必须将其去掉。如是冷冻精液，其中还含有防冻剂和蛋黄等成分，这些成分将可能干扰正常受精过程，受精前亦有必要将其去掉。此外，精子的活力亦是影响体外,受精的重要因素之一，过多的死精子留在受精液中将不利于卵母细胞的受精完成，也应将其去掉。因此，精子的分离于制备实体外受精激素的一个关键环节。,1悬浮法,将精液置于含有15,ml,获能液或受精液的试管底部，在培养箱中培养1030,min,后,吸取上层液体,而后离心洗涤12次,即可获得高活力的洁净精子。此法适用于精子活力较差的精液,但精子往上游动不充分,利用率低,对于价格昂贵的优良种畜精液应慎重考虑。,2玻璃棉过滤法,许多实验室采用小玻璃珠柱层过滤法来滤除已稀释牛精液中的死精子，此法可大大节约精子的制备时间，但器材较昂贵。,3哌可（,Percoll）,密度梯度离心法,根据形态正常精子的密度高于异常的精子,经平衡离心后形态正常的获能精子将集中于高密度的哌可区,从而分离的到高受精力的精子。常用的哌可密度梯度为30%和 45%,平衡离心10,min,梯度离心法可分离得到更高质量的精子,且精子的利用率也较高。但哌可梯度离心法分离得到精子的体外受精效果易受哌可质量影响。,4离心洗涤法,取0.10.2,ml,的精液放入含有510,ml,的获能液或受精液的离心管中，而后离心2次即可。此法的优点是操作简单，精子的利用率高。但需在受精前估算精子的活力，因为从此法获得的精子没有经过活精子的筛选。,（二）精子的获能,1肝素处理法,此法是目前应用广泛的精子获能处理方法。将一定浓度的肝素直接添加到受精液中进行受精，受精液中的肝素浓度一般为210,ug/ml，,应注意的是，不同的动物要求不同浓度的肝素。,2钙离子载体法,钙离子载体,A23187,可直接诱发,Ca,2+,进入精子细胞内，提高细胞内的,Ca,2+,浓度，从而引起精子获能。处理方法是，首先将精子加入含有0.51.0,umol/L,的不含的受精液中处理约5,min，,然后加入等量的含1%,BSA,的受精液，以终止,A23187,的作用，随后精子可用于体外受精。,3高渗溶液处理法,据报道，当精子与高渗溶液作用时，精子表面富含的被膜蛋白将脱落，从而导致精子获能。一般用的高渗溶液为360380,mosm。,虽然如此高渗的溶液对精子有一定的高渗打击，但受精效果不错，故至今仍有人使用此法。,4卵泡液处理法,卵泡液含有来自血清的大分子物质，且含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在培养液中加入一定浓度的卵泡液将有可能诱发精子的获能。但卵泡液含有精子活动的抑制因子，因此，卵泡液可用于精子的获能处理，但不能用于体外受精系统。,5血清白蛋白溶液孵育,血清白蛋白是血清中的大分子物质，具有很强的结合胆固醇和锌离子的能力，可除去精子质膜中的部分胆固醇和锌离子，降低胆固醇在精子质膜中的比例，进而改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。但该法需要时间较长，且诱发精子获能的作用不强，目前仅作为精子获能的一种辅助手段。,（三）受精方法,1微滴法,此法是目前应用最为广泛的一种受精方法。其做法是先在培养皿中用受精液制作成20,ul,或40,ul,的微滴并覆盖石蜡油，置于,CO,2,培养箱中平衡至少2小时。然后，每滴放入1020枚已培养成熟的卵母细胞和经处理的精子，精子在受精液滴中的最终浓度一般为1210,6,ml。,应指出的是，不同的公牛要求不同的精子浓度。,2四孔培养板法,首先在四孔培养板的每孔中放入0.51.0,ml,的受精液，置于,CO2,培养箱中平衡至少2小时。然后，每孔放入50100枚已培养成熟的卵母细胞和经处理的精子，精子在受精液滴中的最终浓度同上,。,3、精子显微注射受精,（1）卵子的收集和处理,目前用于显微注射的卵可以通过激素超排的方法获得，也可采用体外成熟的卵子。卵母细胞在注射前采用0.1%透明质酸酶除去卵丘细胞，对于脂肪含量较多的牛和猪卵母细胞，还应对其进行离心处理，以便使卵母细胞中的脂肪滴被甩向一侧，胞质变的透明，便于注射的操作。,（2）精子或精核的制备,精子注射前，要对其进行孵育获能处理。如果注射的是精子的头，则需要对其进行超声波处理和蔗糖密度梯度离心分离精子的头。制备好的精子可单独置于含有8%10%聚乙烯吡咯烷酮或甲基纤维素的操作液微滴中。此外,可在精子注射的操作液中加入5,mmol/L,的二硫苏糖醇,可使注入卵胞质的精核更易发生解聚。,（3）精子或精核的显微注射,目前用于精子显微注射的方法有常规和压电子素微操作法，两者主要在注射管及驱动动力上有区别。前者需要斜口针，且要拉一针尖，后者使用平口针即可。,（4）卵子的激活,目前激活卵母细胞常用的方法有钙离子载体,A23187,处理、电激、酒精处理、离子霉素+6二甲氨基嘌呤(6-,DMAP)、,离子霉素+放线菌酮(,CHX),等。目前，较为有效的激活方法是先用5,umol/L,的离子霉素激活处理卵子5,min，,然后在含有2,mmol/L6-DMAP,的培养液中培养3小时。,四、早期胚胎的体外培养,（一）培养液,早期胚胎的体外培养液一般可分为简单培养液和复合培养液。简单培养液，如,CR1,液、,BMOC-3,液.,CZB,液和,SOF,(synthetic oviduct fluid),液等，复合培养液，如,TCM199、CMRL1066、Ham F-10,液等。所有培养液的基本成分主要包括无机盐、碳水化合物、氨基酸、蛋白质、维生素及其他的生长因子等。按其功用可分为渗透压维持因子、代谢底物和代谢调节因子。,1,、,培养液中的无机盐主要包括,Na,+,、Cl,-,、K,+,、Mg,2+,、Ca,2+,、PO,4,3-,、SO,4,2-,和,HCO,3,2-,等。,Na,+,、Cl,-,调节渗透压。,2、能量底物亦是胚胎培养液中的一种重要成分，包括葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠和谷氨酰胺等。氨基酸是蛋白质合成的前体，同时也参与胚胎的能量代谢。,3、维生素作为碳水化合物和氨基酸代谢过程中必不可少的成分，能促进细胞对葡萄糖的摄取和乳糖的合成，从而影响胚胎的代谢和发育。,4、在培养液中添加一定比例的生物体液和蛋白质对胚胎的发育也有促进作用。,5、激素是胚胎发育的调节因子，激素对胚胎体外发育的影响具有明显的阶段性。据研究，在培养液中添加生长因子，能增加胚胎的细胞数和提高胚胎的质量。而环一磷酸腺苷几乎是所有激素作用的细胞内信号转导因子，它们对细胞的作用更为直接,与激素的受体存在与否无关。,（二）体外培养系统,1常规培养系统,将胚胎单独培养在培养液中，不添加任何其他细胞及其分泌因子。常规培养系统又分为微滴法和培养板法。微滴法是在塑料培养皿中制作30100,ul,的微滴，上覆石蜡油，然后将胚胎置于其中培养。该法适用于数量较少的胚胎培养，因较少培养液体积容易建立一个有利于胚胎发育的微环境。如若胚胎数量较多，可采用四孔培养板法，即将胚胎直接置于含有500800,ul,培养液的四孔培养板中培养这样操作相对较简单。丹麦胚胎技术中心建立了一种,WOWs,培养方法，可用四孔板培养小量的胚胎。具体做法为，用针将培养板的底部凿成许多直径为150200,um,的凹窝，然后将胚胎放在其中培养，这样也有利于建立胚胎发育的微环境。,2输卵管的离体培养,人们曾将小鼠的受精卵置于离体的输卵管中，然后进行组织的体外培养，结果发现，小鼠受精卵没有出现发育阻断，能发育到囊胚阶段。但这种方法的胚胎发育率不高，且较为繁琐，故目前较少使用。,3体细胞共培养法,与体细胞共培养是20世纪80年代后期促使体外受精胚胎通过发育阻断的一种有效方法。采用的体细胞有：输卵管上皮细胞、滋养层细胞、卵丘细胞、颗粒细胞、黄体细胞、子宫内膜细胞和羊膜囊细胞等，其中以颗粒细胞和输卵管上皮细胞最为普遍。用于胚胎共培养的体细胞，一般要在移入胚胎前48小时做成微滴单层细胞，使用时换成新鲜的培养液，移入胚胎后，每48小时换液一次。近年来，随着胚胎培养液的不断改良，共培养已无多大必要，故而许多实验室又倾向使用传统的常规培养系统。,五影响体外受精的因素,1卵巢质量,2卵泡的大小和形态,3卵母细胞的类型和形态,4 精子质量,5水质量,6培养箱环境,7化学制剂的质量,六应用前景,(一)体外受精是解决胚胎移植胚胎来源的一项重要而有效的补助技术。,（二）体外受精技术将使“小牛生小牛”变为现实,（三）体外受精技术将使具有优良遗传性状但因老、弱、病、残而淘汰或死亡的母畜继续繁殖其后代变为现实。,（四）体外受精是其他动物繁殖生物技术的关键和核心技术。,