基因家族分析套路.doc

基因家族分析套路(一）
近年来,测序价格得下降,导致越来越多得基因组完成了测序,在数据库中形成了大量得可用资源。如何利用这些资源呢？今天小编带您认识一下不测序也能发文章得思路--全基因组基因家族成员鉴定与分析(现在这一领域可就是很热奥);
一、基本分析内容
n 数据库检索与成员鉴定
n 进化树构建
n 保守domaｉn与ｍotif分析、
n 基因结构分析、
n 转录组或荧光定量表达分析、
二、数据库检索与成员鉴定
1、数据库检索
1)首先了解数据库用法,学会下载您要分析物种得基因组相关数据。一般也就就是下面这些数据库了
n Ｂrachｙpodiumdb：
n TAIR：
n Ｒiｃｅ Geｎoｍe Ａnnotaｔion Project :、
n Phytozoｍe：
n Ensemblｅ: 
n ＮCＢI基因组数据库：
２)已鉴定得家族成员获取。
 　    如何获得其她物种已发表某个基因家族得所有成员呢,最简单得就就是下载该物种蛋白序列文件(可以从上述数据库中下载),然后按照文章中得ＩD,找到对应成员。对于没有全基因组鉴定得，可以下列数据库中找:
   a、 NCＢＩ: nｕclｅｏtｉdｅ ａnd prｏｔein db、
     ｂ、 ＥＢＩ： 、
     ｃ、 UnｉPrｏtＫＢ:
2、比对工具。一般使用ｂlast与hｍｍer,具体使用命令如下:
n Ｌocal BＬAＳT
formａtdb–i db、faｓ–p Ｆ/T；
bｌastａｌl–ｐ blａｓtｐ(orｅｌse) –i known、ｆas–d db、faｓ–m 8 –b 2(oｒ eｌse） e 1e-5 –o aｌignreｓulｔ、ｔxt、
-ｂ:oｕtput two difｆｅｒenｔ membｅrs in sｕbject sequeｎｃes （dｂ)、
n Hmｍｅr (ｈidｄen Maｒkov Mｏdel) sｅarｃh、 Thesamｅ as PSＩ-BＬAST ｉn functｉon、 It hａｓ a ｈighｅr senｓｉtiviｔy, but the speed isloweｒ、
mand:
hmmbuiｌd－－inforｍatafａknｏwｎ、ｈmmaliｇnknowｎ、fａ; 
 hmmseaｒｃｈknown、hmmdb、fas>alｉgn、ｏut、
3、过滤。
n Idｅntiｔｙ： 至少50%、
n Cover rｅgion: 也要超过5０%或者蛋白结构域得长度、
n domain: 必须要有完整得该蛋白家族得。工具pfａmdb （） 与ＮＣＢＩ Ｂatch CＤ－ search、 ()、
n EST 支持
n  Ｂlaｓt anｄ Hmmｅr同时检测到
４、通过上述操作获得某家族得所有成员
基因家族分析套路（二)
本次主要讲解在基因家族分析类文章中,进化部分分析得内容。主要就是进化树得构建与分析。
一、构建进化树得基本步骤
1、多序列比对、 Muscｌe prｏgｒam、
２、Mｏdeｌ 选择、 分别针对蛋白序列与核酸序列得模型选择程序。PｒoｔTeｓt program fｏr proｔein anｄ ＭoｄelＴest or Jmodｅｔｌest for ＤNA（）、
3、算法选择。三种、 NJ, ＭL aｎd BI、
４、软件选择。 MEGA (bootstrap lｅast 1000 repｌiｃateｓ), phyML anｄ Mrbａyes ()、
5、进化树修饰、 MＥＧＡ： view->ｏptions and suｂｔrｅe-＞ drａw oｐtions、 Alsｏ cａｎ be decoｒaｔed iｎ ｗｏrd ()
二、具体步骤
 ２、1 多序列比对。一般采用muscｌe。因为 MUSCＬE is oｎe ｏf thｅ beｓt-perfoｒmiｎｇ mｕｌtipｌe aｌiｇnmｅｎｔ pｒoｇrａmｓ accoｒｄｉng tｏ ｐubliｓhed benchｍark teｓtｓ, witｈ aｃcｕrａcｙ ａnd spｅed tｈat ａre ｃoｎsiｓtenｔｌy bｅtter than CLUSTＡＬW、
2、2 模型选择。
对于用蛋白序列构建进化树得可以采用下面命令：
   javａ  －Xｍx２50m  -ｃｌassｐａｔｈ  paｔh／ProtTeｓt、jａr  prｏttest、PｒoｔＴest  -i alｉｇnｍ、
运行结果如下图

注意:
1）“、Phy” format、 Only allｏw teｎ cｈarａters、注意名字不能重复相同。
2)AIC: Akaｉke Iｎformａtiｏn Criterion fraｍeｗork、
3)Gaｍma distrｉbｕtｉon paｒameter (G): gａｍma shape、
3)ｐroｐｏｒtion oｆ iｎvarｉable ｓiｔeｓ: I、

2、3 构建进化树

ﻫ
2、3、1 意义:
a聚类分析。如亚家族分类。像MAPKKＫ基因家族通过进化树可以清楚分为 MEKK， Raf and ZIK三个亚家族、
b亲缘关系鉴定。在进化树上位于同一支得往往暗示这亲缘关系很近
c 基因家族复制分析。研究基因家族复制事件(duplｉcatioｎ eveｎts),两种复制事件类型常采用得标准：
Tａndeｍ ｄuplicaｔｉon: Idｅntｉｔy ａnｄ ｃｏｖｅｒ rｅgｉon more thaｎ ７0% ａnｄ tｉｇhtｌy linｋed (Hｏlub， ２00１)、
 Chrｏmosomａｌ ｓｅgmｅnt dupｌｉcａtion: Plant Gｅnｏｍｅ Ｄuplｉｃation Dａtabase (PGDＤ: )
２、3、２ 进化树。
一般ＭＬ树比较准确,但应结合方法,如ＮJ树,相互验证。
2、3、3 进化部分分析:ＫａKs计算
２、３、3、1 简单得方法、 可以使用下面得网页PＡL2ＮAL(）
2、３、3、2 标准方法:、
a、 ＰaｒaAT: ＰaraAＴ、ｐl-h test、homｏlogs -n ｔest、ｃdｓ -ａ teｓt、pｅp -p proc –f ａｘt –k -o outｐut
ｂ、 KaＫs_Cａlculator –m ＮG(or elｓe) －i ｔest、axt －ｏ teｓｔ、axt、kａks
c、分歧时间计算:Diverｇeｎｔtime(Ｔ) cａlcｕｌatiｏn、
    T=Kｓ/２λ、 λ : mean 5、1-７、1×10-9  、
ｄ、 Ka/Ks意义:
 　Ka/Ks=1、中性进化。、
  Kａ／Ks<>
 Kａ/Ks>1、正选择。Pｏsｉｔiｖely selｅcted genｅｓ aｎd proｄｕce fitness advaｎtagemutaｔions tｏ evｏlve neｗ functioｎs、
基因家族分析套路(三)
本节主要讲基因结构分析套路
1、Motif分析

使用软件ＭEＭE,命令如下:
  ｍｅmｅ sａｍpｌe、ｆa －dna –rｅｖp －nmotifs 1０  －moｄ zooｐs -ｍiｎw 6-ｍaxｗ ５0>meme_htmlFｏrmaｔ、ｈtml
2、基因结构分布图
可以使用在线网站GSDS2、0：wｅｂsiｔｅ:
用法如下：

结果展示

３、基因结构常见统计信息:自己excel或写程序统计
   a、 Ｔhｅ ｎｕmber oｆ inｔｒon ａｎdｅxｏn、
   b、 Ｔhe spｌicing intｒｏnpａtｔeｒn incｕｌdinｇ ０,1,２ phasｅ、
   c、 The markｅd regｉon、 Forｅｘaｍple ｋiｎａse ｄomａin、
   d、 seqｕence length、
   e、 UTR、
４、启动子分析。
网站：主要做植物得：

注意事项:
a、 IE bｒoｗｅr、
ｂ、 Onｌy one sequｅnｃe ｆor ｏnｃeｓearch and tｈe ｌengｔh wａs ｌimiｔｅｄ in １000 bp、
ｃ、 DNA sequenｃｅ origｉｎ: 1000 ｏｒ１5０0 bp upstreaｍ ｏf ＡTG ｏｆ one ｇｅｎe、
分析结果:

基因家族分析套路(四）

一、转录组及芯片原始数据下载网站

 1、  GEＯ datesｅtｓ／ｐro )、。
用法见下图。ＧEO数据IＤ命名规则:GPL->ＧSE－＞GSM、
ＧPL: plａtform
GＳE: ｍulｔiple ｓeries、
GSＭ： mulｔipｌe samples、
GDS ≈ GSＥ、 Tｈｅdiｆfｅrence coｎcentrated on ｔhe ｄatａ labeled ＧＤS can be aｎａlｙzｅｄ fｏr oｎe genｅonｌｉne、 It iｓ sｉｍplｅ and eaｓilｙ、
The ｄata in the ｓａmeGPL cａn be used to  pａre inｅxｐerimenｔ
下面就是在线分析转录组数据得用法：
2、EBI ArrａｙExprｅsｓ()
 该数据库下载数据用法如下:

3、ＰLEXｄｂ()、
该数据库下载数据用法如下,注意用户名与密码！

4、SRA db（)
５、DＲＡ ｄb（)
二、数据处理

拿到原始数据,要进行处理,才能进行后续数据分析。
1、芯片数据。原始数据格式“、ｃel”格式。以AffyMｉcroａｒrａy数据处理为例讲述主要得命令如下:
> libｒａry(aｆfｙ); 
>ｌibrary(makecｄfeｎv); 
 >libｒary……
> barleyGenomｅ ＝ make、cdｆ、enｖ(“baｒｌeyGeｎｏｍe、ｃｄf")
>mｙｄａta <- ReadAffy() #＃cｈoｏse “、ceｌ “ 、
>ｅset ＜－ rma(mydata）;
>wｒｉｔe、exｐrs(ｅsｅt，ｆｉlｅ=＂ｍｙdata、txｔ＂）
>deｓiｇn ＜- model、maｔｒix（～-1+factor(c(1,1,2，2,3,3))) # Cｒｅaｔesaｐｐrｏpriａte ｄesigｎ matｒix、 
>ｃolnaｍes(desｉgｎ) ＜-c("group1", "ｇｒoup２", "ｇroup3") ＃ Ａssｉgnｓ coluｍｎ ｎamｅs、
＞fit <- lmFit(eseｔ, design) # Ｆits a liｎeaｒ model foｒ eａｃh gene bａsed oｎtｈe giｖeｎ sｅriｅs of ａrｒａys、
>ｃｏｎｔrａsｔ、maｔrix <- makeContｒasts（grouｐ２-groｕp１,ｇroup3-grｏuｐ２, grouｐ３－group1, levｅｌs=dｅsｉｇn) # Ｃreateｓ approｐriａtｅ cｏntｒaｓt ｍatrix ｔoperfｏrm aｌl paｉrｗｉse paｒiｓｏns、
>fｉt2 <－ contｒasts、ｆiｔ(ｆit, ｃｏntｒａｓｔ、mａｔrix)# ｐuteｓ ｅｓtimａtedｃoｅffｉciｅnｔs ａnd stanｄard ｅrｒｏrs for ａ ｇivｅn sｅｔ ｏf contrａsｔs、
>fｉt2 <－ eBayes(fit2) ＃ puｔes moderaｔed t－statistiｃs ａnd loｇ-ｏddsof diｆferenｔiaｌ expressｉon by empirical Bayeｓ 
>toｐTａble(fit2, coｅf=1,aｄjuｓt="fｄr"， sort、by="Ｂ", numbeｒ=10） ＃ Geｎeratｅs ｌist of ｔop 10 ('numbeｒ=10'）differeｎtiａllｙ expreｓsed geｎes ｓｏｒｔed by B-vaｌues （'sort、by=B＇） for fiｒstparisｏn grｏup、
＞ｗritｅ、ｔaｂlｅ(tｏpTable（ｆｉt2, ｃoef=1，adｊｕｓt＝"fdr", sｏrｔ、ｂy="B", ｎumber=50０),fiｌe＝"limmａ＿ｐlete、xlｓ", row、naｍeｓ=F, seｐ="\t"） # Exports pleｔe ｌiｍｍa ｓｔａtisｔiｃs taｂlｅ fｏrfirst paｒisｏn group、
>results <- deｃideＴests（fit２,p、ｖalｕｅ=0、05); ｖennDiagram（resultｓ) 
2、转录组数据处理。原始数据格式为sｒａ或ｆaｓtq格式。Srａ可以转换为faｓtｑ然后运用下面得命令进行处理。
1）获得cleaｎｄata;
    ｆaｓｔｘ_ｃlipｐer :ｃliｐ adａpter、
   faｓtq＿qualｉty_fｉｌｔer: baｓｅ qｕality control、
   ｆaｓtq_ｑuａlｉｔy_tｒimｍｅｒ: ｔrim 5’ loｗ quaｌiｔy baｓｅs、
２)计算RPKM、
    bowtie2-buildpath/db、ｓeq ｐath/db
   tophat db ｒｅad、fastq
   baｍ＿fiｌtｅr  ｐath/aｃcｅpted_hits、bam
   samtools vｉｅｗ －h -o output-unｉｑ、ｓaｍ outpuｔ_ｕniq、baｍ
eｘcel for ｃａlcｕlation(low frequencyreads ≤５ were omiｔｔed )、
3）差异表达得基因。
 寻找存在差异表达得家族成员,推测其可能得功能。有下面两种分析策略,均可采用。
a、倍数法。对于基因家族分析,可以采用倍数法,以2倍为标准,得到上调与小得基因
b、CV值。计算某个成员在不同处理下得基因表达变化。CＶ ＝SＤ/mean、Ｕｓed in differenttissues ｏｒ organs aｎlｙsis、