亚慢性毒性试验.doc

毒理学作业
农药2,4-滴钠盐原药 为白色粉末，水溶性，表1就是其对SD大鼠得急性经口试验结果，请根据表中结果，给出该农药得90天亚慢性试验得试验方案，以及如何对保证实验质量予以控制。
表1 2，4-滴钠盐原药对SD大鼠急性毒性实验结果
动物性别
剂量（mg/kg)
动物数（只）
死亡数（只）
LD50及95%可信限（mg/kg)
雌
215
5
0
584
（430~794）
464
5
1
1000
5
5
2150
5
5
雄
215
5
0
501
（344~730）
464
5
2
1000
5
5
2150
5
5
剂量设置高剂量为25%LD50，中剂量为12、5%, 低剂量为6、3%。
雌性LD50为584mg/kg，高剂量为146mg/kg,中剂量为73mg/kg,低剂量为37mg/kg；雄性为501mg/kg，高剂量为125mg/kg，63mg/kg,低剂量为31mg/kg。
根据GB15670《农药登记毒理学实验方法》得农药急性毒性分级标准，2，4-滴钠盐原药得LD50>500mg/kg，属于低度农药。因此试验时选择SD大鼠得LD50为584mg/kg。
农药2,4-滴钠盐原药SD大鼠亚慢性毒性试验
目得; 研究喂饲农药2,4-滴钠盐原药对大鼠得亚慢性毒性。
方法：取初断乳 SD大鼠80只，雌雄各半按照体重随机分为4组。将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别拌入饲料内经口喂饲染毒90d。
观察：大鼠外观体征、体质量、进食情况等。在实验中期与末期采血检测检测血液学。试验末期检测血生化指标以及尿常规检查。实验结束时处死实验动物，计算脏器指数，并对主要脏器进行病理组织学观察。
1 材料与方法
1、1 受试物
农药2,4-滴钠盐原药，白色粉末，水溶性，由某地某农药公司提供。SPF级初断乳大鼠80只，雌雄各半，体质量50~100 g，由XXX实验动物研究所繁育场提供，动物合格证号为医动字第XX-XXXX号。
1、2 饲养与管理
SPF 环境条件下，同组同性别两只一笼喂养，自由进食与饮水。环境温度 21～25℃，相对湿度 40%～60%。严格控制昼夜交替。
1、3实验方法
试验前将雌、雄大鼠各半按体重随机分为3个剂量组与1个对照组，每组20只，将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别均匀混入饲料中制成颗粒饲料辐照灭菌后分别供高、中、低剂量组动物食用，连续每日一次喂养90d；对照组给予不加受试物得正常饲料。
1、4 观察指标
1、4、1一般情况
试验期间观察动物得一般情况包括外观体征与行为活动、粪便性状、食物摄入量及体重变化等。
1、4、2血常规
在实验中期与末期按常规方法测定血液学指标
1、4、3血液生化指标
试验末期检测血液生化指标
1、4、5尿常规检查
尿常规测定颜色、 pH值、比重(SG)、 尿糖(GLU)、 尿蛋白，将尿液离心， 并对尿中沉淀物进行镜检。
1、4、6脏器病理
解剖动物，取心、 肝、 脾、 肺、 肾、 胃肠、 肾上腺、胸腺、 脑与卵巢、 睾丸等脏器，观察大体变化并称重（胃肠除外），计算脏器指数[脏器质量/体重）×100%]。
将解剖取得得脏器福尔马林固定，常规制片，HE 染色，光学显微镜进行病理组织学检查。

1、5 统计学分析
亚慢性毒性试验结果经正态性检验后，符合正态得指标采用SPSS13、0统计软件进行单因素方差分析，否则经变换后分析。

２ 结果
2、1 一般状况
2、2 体重变化 见表2
2、3 血常规检验结果 见表3
2、4 血生化检测结果 见表4
2、5 尿常规检查
2、5 脏器指数 见表5
2、6 病理组织学检查
表2 2，4滴原药大鼠90 d亚慢性毒性试验体质量变化情况
性别
剂量（mg/kg)

染毒周数

0
2
5
8
10
13
雌
0
37
73
146

雄
0
37
73
146

表3 2，4-滴钠盐原药大鼠90 d亚慢性毒性试验血液常规检验
性别
剂量（mg/kg)
RBC/(×10L)
Hb/(gL)
WBC/(×10L)
GRA/%
LYM/%
雌性试验前
0
37
73
146

雄性试验前
0
37
73
146

雌性试验后
0
37
73
146

雄性试验后
0
37
73
146

表4 2，4-滴钠盐原药大鼠90 d亚慢性毒性试验血生化检测结果
性别
剂量（mg/kg)
AST/(UL)
ALT/(UL)
ALP/(UL)
BUN/(mmol L)
TP/(g L)
ALB/(g L)
雌
0
37
73
146

雄
0
37
73
146

表5 脏器指数%
性别
剂量（mg/kg)
大脑
肝脏
脾脏
心脏
肺脏
胸腺
肾脏
肾上腺
睾丸（卵巢）
雌
0
37
73
146

雄
0
37
73
146

3. 讨论
控制实验质量
1 大鼠毒理学实验中实验技术因素得质量控制
1、 1 动物临床观察指标得质量控制
在药品临床前大鼠毒理学实验研究过程中 , 其临床观察指标主要包括行为活动 、体质量 、增质量 、饲料生物利用度等 ，而体质量 、增质量 、饲料生物利用度指标均为需要统计分析得客观指标 。因其贯穿于整个实验周期 ,数据得客观性与实验环境 、给药过程中动物感受就是否舒适 、动物密度 、动物健康状况等因素相关 。在动物临床指标统计分析前控制体系中 , 实验环境应选择 S P F级动物实验室 ;每笼 2只 ;体质量在实验前应适应环境周期 ≥1周 ; 计算饲料摄入量每日应称质量 , 每周给药完毕即计算大鼠得饲料生物利用度 ,比较分析各组动物饲料生物利用度得统计学意义 ; 分析产生差异得原因 ,讨论差异就是否与动物自发性疾病 ( 如大鼠自发性糖尿病会引起大鼠饲料生物利用度明显增大 ) 有关 , 同时应排除营养因素或给药途径对动物得损伤因素 ; 在动物行为活动指标观察中应在每日投药过程中重点观察大鼠投药部位就是否发生充血 、水肿 、呕血 ,就是否发生动物争斗外伤 、皮毛稀疏竖散 、粪便性状改变等变化 ,并及时处理与药物因素无关得改变 ,并详细记录 ,认真分析 。
1、 2 血液学样本得质量控制
大鼠慢性毒理学实验中血液学常规得检测项目主要有红细胞计数 ( R B C ) 、血红
蛋白定量 ( H b ) 、白细胞计数及其分类计数 ( WB C+D C ) 、血小板计数 ( P T ) 、凝血时间 ( C T ) ; 血清生物化学检测项目主要有天门冬氨酸氨基转移酶 ( A S T ) 、丙氨酸氨基转移酶 ( A L T ) 、碱性磷酸酶 ( A L P ) 、总蛋白 ( T P ) 、清蛋白 ( A L B ) 、总胆固醇 ( T -C H O ) 、总胆红素 ( T - B I L ) 、空腹血糖 ( G L U ) 、尿素氮 ( B U N ) 、肌酐 ( C r ) 。选择合适得血样采集法，不仅对动物损伤小 、样本溶血率低 、可重复采样等优势 ,而且使大鼠慢性毒理实验中分阶段检测药物对造血系统 、生化系统得影响成为可能。

1、 3 动物病理组织标本分析前得质量控制
组织病理学检查对于判断实验动物得毒性靶器官或靶组织具有重要意义 。在长期毒理学实验中有重要地位 , 就是评价药物毒性得重要依据。组织病理学检查对判断动物得毒性靶器官或靶组织具有重要意义 。实践中使用得组织学检测前优质标本取材流程可以为 : ①根据实验取材项目设计表格 ,需要取得脏器系数得器官或组织与其她器官或组织分别标示于一个完整得记录单元中 ; ②使用 250 m L广口瓶贮存新鲜配制得 10%甲醛溶液 180 ～ 200 m L 备用 ; ③对拟取材得大鼠进行解剖分组顺序编号 ; ④大鼠麻醉状态下 ,股动脉放血致死→胸腔组织 ( 胸腺 、心 、肺 ) →腹腔组织 ( 胃 、十二指肠 、空肠 、回肠 、盲肠 、直肠 、肝 、脾 、胰腺 、肾上腺 、肾 、卵巢 、子宫 、膀胱 、前列腺 、睾丸 、附睾 ) →颈 、脑部组织 ( 甲状腺 、脑 、垂体 、脊髓 ) 。其中胸腺 、胰腺 、肾上腺 、卵巢 、甲状腺 、垂体 、脊髓等腺体组织或微小组织应使用擦镜纸或纱布非挤压式包裹置于 3、 6% ～ 4、 0%甲醛 。这样使浸泡于甲醛溶液中得易混淆脏器在进行石蜡包埋时容易分辨 ,同时保证病理组织学检查中组织样本数目完整 ; 其她组织除大体观察有明显病灶得组织外 ,要求动物组织样本均取自该组织得代表区 。

1、 4 动物实验中得给药途径不同而引起得取材质量控制
因临床给药途径不同 , 在大鼠慢性毒理实验项目中存在不同得给药方式 , 主要给途径有主要给药途径有灌胃 、直肠 、舌下 、腹腔注射 、肌内注射 、皮肤涂抹等。在毒理学研究中可能通过对直接接触药物部位得检测结果分析药物慢性刺激对直接刺激局部组织得影响 ,还可以分析药物吸收与给药技能合理与否 。

2 影响大鼠毒理学实验结果得环境 、动物福利 、误差控制
2、 1 毒理学实验中得环境控制
在不同环境中进行动物实验得大鼠 ,对照组与药物组动物均不同程度地存在因环境所致得炎性细胞浸润或间质性肺炎等病理变化 ,这些变化与实验环境级别及日常消毒措施合理与否息息相关。样本固定前得大体解剖观察处理与组织学检查结果具有直接关系 ,取样以肉眼能观察到病灶得肺叶与表面观察正常得肺叶各取一为原则 ,在同一个受试动物肺组织中不可单一地单纯选择大体观察异常得小叶或大体观察正常得小叶样本 。

2、 2 毒理学实验中得动物福利控制
动物在毒理学研究过程中，会产生紧张 、疼痛 、呼吸困难 、痉挛 、颤抖 、腹泻 、孔道出血 、瘫痪 、休克 , 甚至死亡得情况 。因此 ,它们在遇到恐惧或恶劣环境时 ,生理与心理都可能患病 。控制原则为实验人员投药过程时间宜短不宜长 , 抓取动物轻拿轻放 , 血清采样宜快不宜慢 ,尽量提供人为因素影响小得实验环境，要求实验研究人员具备爱护动物之心与熟练得动物实验技能并贯穿于整个实验周期 。

2、 3 毒理学实验中得误差质量控制
在大鼠慢性毒理学实验中系统误差主要与样本得随机性 、实验操作得一致性 、流程得恒定性有关 。 ①抽样误差 : 一般情况下 ,慢性毒性实验中每个实验组应使用相等数量得雌 、雄动物 。每组动物大鼠至少 20只 。差异应不超过平均体质量得 20%。 ②系统误差 。包括下列两类情况 。实验技术熟练因素造成得误差 : 在毒理学实验研究中 ,为了真实反映外来化合物得毒性 ,除了要统一各种实验条件外 , 每日得给药时间应一致 。一就是可比性强 ,二就是为了避免错误而影响其她药理实验甚至临床用药 。因此 , 应将实验人员得技术熟练因素以一定得模式贯穿于各实验组中 ,在整个给药期中给药人员每天应互换给药得组别 ,同时应保证给药时间得准确性与一致性 ；流程造成得误差控制 : 系统误差可因分析方法 、仪器校正错误 、试剂纯度不够 、检测者得感观 、环境因素改变等因素造成 ;随机可能因动物实验过程中各种随机因素得共同作用等因素造成 。如实验过程得温度波动 - 电压变化 - 仪器故障 - 操作技术差别等 ; 过失误差可因工作人员不负责任( 器皿不净 、加样错误 、计算错误 ) 而造成。这些误差因素与实验结果判断有直接关系 。在药物安全性评价中 ,系统误差与动物就是否接受了足够得药物及其在动物体得代谢时间相关 。比如空腹抽血与进食后抽血 ,对临床患者得 T G 、C K 、C h o 、G L U等有明显影响 。因此每个实验期进行动物抽样时 ,就要求严格按照同等得禁食时间对大鼠禁食 。因此要特别注意各组实验大鼠采样得随机性与均一性。