微生物实验实验一显微镜的使用及微生物形态观察.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微生物实验,实验一 显微镜的使用及微生物形态观察,实验二 活性污泥生物相及藻类形态观察,实验三 微生物的染色,实验四 微生物细胞数的计数,实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别,1-1,实验一 显微镜的使用及微生物形态观察,一,.,目的,1.,了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用）,2.,观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。,二,.,实验器材,1.,光学显微镜,2.,示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。,1-2,三,.,实验内容,(,一,),显微镜的构造和使用方法,1.,构造,机械部分,:,镜筒,(,双筒，两筒间距离可调，上装有目镜）,转换器,（,3,孔，装有物镜）,载物台,（中央圆孔、弹簧夹、移动器）,调节器,（粗调、细调）,镜臂,（支撑作用）,镜座,（上有光源，亮度可调）,光学部分：目镜,（,10,、,16,）,物镜,（低倍镜,10,、高倍镜,40,、油镜,100,）,聚光器,（内有光圈调节）,光源,（光量可调）,1-3,显微镜放大倍数,=,目镜放大倍数,物镜放大倍数,物镜上的标识：,1.25(0.65,、,0.25)100(40,、,10,）,160/0.17,数值孔径 放大倍数 镜筒长 盖玻片厚度,数值孔径：,N.A.=ns i n/2 n,玻片和物镜之间的折射率。,光线最大射入角。,分辨率（最大可分辨距离）,/,N.A.,波长,1-4,2.,显微镜的使用,低倍镜的使用,（,1,）双手取出显微镜置于实验台上，接上电源，打开开关，调节合适光量。（,2,）转动转换器，将低倍镜移至正下方。调节两目镜镜筒间的距离。（,3,）将载玻片放在载物台上夹住，移动观察对象于圆孔正中。（,4,）侧视物镜，转动粗调将载物台上移，至载玻片距物镜头约时停止。（,5,）双眼向目镜里观察，同时旋转粗调节器使载物台缓慢,下移,，若,标本显出但不清晰，可用细调节器调至清晰。若粗调旋转太快，超过焦点没有看到标本，则必须重复（,4,）、,(5),步骤。不能在眼睛观察目镜的同时旋转粗调，以防物镜与载玻片相碰撞，造成损坏。,1-5,高倍镜的使用,在用低倍镜找到观察目标后，若需要进一步放大观察，将其移到视野中央。用转换器将高倍镜移到镜筒下方，将光量调大一点。若标本不清晰，用细调上下转动使之清晰。（,此时不再动粗调,）,显微镜的维护,（）将载物台降至最低，取下标本片。（）将光量调至最小，关上电源。（）用镜头纸先檫目镜、物镜，再擦显微镜其它部分。（）将显微镜放入镜箱，还原。,1-6,（二）微生物形态的观察,1.,用低倍镜和高倍镜观察,颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。,2.,画出微生物形态图，并标明显微镜的放大倍数。,10,10,颤藻,2-1,实验二 活性污泥生物相的观察,一,.,目的,1.,学习测量微生物大小。,2.,学习用压滴法制作标本片。,3.,观察几种原、后生动物，菌胶团及藻类个体形态。,二,.,实验器材,1.,活性污泥混合液。,2.,单胞藻、新月藻、草履虫等示范片。,3.,显微镜、载玻片、盖玻片。,4.,目测微尺、物测微尺。,2-2,三,.,实验内容,1.,微生物大小的测定,(1),标定目镜测微尺,装在目镜上的目测微尺中央刻有等分为,100,格或更多格的标尺，使用前要用物测微尺标定。物测微尺中央刻有,1mm,长的标尺，等分为,100,格，,10,m,格。将物测微尺的刻度朝上放在载物台上，用低倍镜找出物测微尺的刻度，移动物测微尺使其第一条线与目测微尺的第一条线重合，顺着刻度线找出另一条重合线。算出,低倍镜下目测微尺每格的长度。,换高倍镜用同样方法标定出,高倍镜下目测微尺每格的长度。,2-3,测微尺示意图,(2),微生物大小的测量,将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再按目测微尺,1,格的长度算出微生物的长度和宽度。,2-4,2.,压滴法观察活性污泥中生物相,（,1,）压滴法制作标本片,用滴管取活性污泥混合液一小滴，放在载玻片中央。取一块盖玻片先将一边与混合液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在混合液上。片内不能有气泡。,（,2,）观察活性污泥中生物相,先用低倍镜观察活性污泥中菌胶团、原生动物、后生动物。画出所观察到的生物形态图。,标明名称、放大倍数和微生物的大小,。,2-5,四,.,实验结果,1.,低、高倍镜下目测微尺每格的长度。,2.,画出,23,种污泥中所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小。,3.,画出两种藻类生物形态图，标明名称、放大倍数,和微生物的大小。,。,3.,观察几种藻类的个体形态,观察几种藻类的个体形态，,画出生物形态图，标明名称、放大倍数。,3-1,实验三 微生物的染色,一,.,目的,1.,学习微生物的染色技术，掌握微生物的单染色法和革兰氏染色法。,2.,学习油镜的操作。,二染色原理和油镜的工作原理,1,油镜工作原理,油镜的放大倍数最大（,100,），故镜头焦距短，直径小,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是从玻片进入空 气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介质密度不同，有些光会,因折射或反射而 不能进入,镜头。物象就显 现不清。,为了不使通过的 光线有,所损失，须在油镜与玻片,之间加入折射率和玻璃,(n=1.52,）相仿的香柏油,(n=1.515),。故而称之为,“油镜”。,3-2,2,单染色法：,微生物不但个体微小，且无色半透明。要在显微镜下观察清楚，必须染上颜色。微生物细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质：在酸性溶液中结合质子带正电；在碱性溶液中给出质子而带负电。等电点一般在,pH=25,。所以，在中性、碱性或弱酸性溶液中，微生物细胞通常带负电荷。碱性染料在电离时，染色部分是带正电荷的，容易与带负电荷的菌体结合使之着色。经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下很容易观察。,3-3,3,革兰氏染色法：,革兰氏染色法将细菌分为,G,和,G,-,，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫,-,碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。,G,细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫,碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。,G,-,细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫,碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。,3-4,三实验器材,1,显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。,2,结晶紫染液、碘液、,95%,乙醇、沙黄染液。,3,菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。,3-5,四实验内容,(,一,),单染色,1,涂片,取一块载玻片，用记号笔划分出两区域并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中，和匀后涂成薄膜。,2,干燥,室温自然干燥或吹干。,3,固定,涂面朝上，通过火焰,23,次。,4,染色,在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆盖,2,分钟。,5,水洗,傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。,6,干燥,室温自然干燥或用吸水纸吸干。,3-6,(,二,),革兰氏染色,完成单染色的,16,步骤后,7.,媒染,加媒染剂碘液使之覆盖,1,分钟，水洗，吸水纸吸干。,8.,脱色,滴加,95%,乙醇数滴使之覆盖,16,秒钟，立即水洗,吸干。,9.,复染,用沙黄（番红）液复染,2,分钟，水洗，吸干。,(,二,),镜检,先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察的样品区域后，用转换器将物镜转到空挡，在样品区域滴加香柏油，再将油镜慢慢转到工作位置浸入油中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。,油镜用完后，用镜头纸沾取乙醇,-,乙醚混合液檫拭油镜头。再用干的镜头纸檫干镜头。,3-7,五实验结果,观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。,六思考题,通过实验，你认为革兰氏染色成功关键是那一步？为了避免假阳性或假阴性出现，在对未知菌种做革兰氏染色鉴定时，你认为应该怎样做？,4-1,实验四微生物的计数,（显微镜直接计数法）,一目的,1.,了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。,2.,观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活细胞的方法。,二,.,实验器材,显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、盖玻片。,4-2,三原理,1.,血球计数板计数原理,血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条横槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，中间大方格为计数室：边长为，深为,0.1mm,，容积为,0.1mm,3,(10,-4,ml),。,计数室有两种规格：一是分为16个中方格，每中方格中有25个小方格；另一种是分为25个中方格，每中方格有16个小方格。两种都共有400个小方格。,4-3,计数：,数出,5,个中方格中的总菌数,A,，若菌液的稀释倍数为,B,，则计算公式如下：,(,1)25,个中方格的计数板计算公式,(,2)16,个中方格的计数板计算公式,2.,区分酵母菌死活细胞基本原理,美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的或淡蓝色，而死细胞或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别,。,四,.,实验内容,1.,酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别,(1),在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。,(2),将标本片放,3,分钟后，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。,4-4,2.,酵母菌液的计数,(,1),镜检计数室,对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能 进行计数。,(2),加样品,在血球计数板上盖上盖玻片,用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置,5,分钟。,(3),计数,将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。每计数室计,5,个中格（四角和中间）。计数原则：计上不计下，计左不计右。芽体占母细胞一半时算一个。,(4),清洗血球计数板,计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。,4-5,五,.,结果记录,1.,2.,酵母菌死活细胞的比例？,六,.,思考题,用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌体的总和？,5-1,实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别,一,.,目的,1,掌握配制培养基和制备无菌水的方法。,2.,学会玻璃器皿的干热灭菌和培养基高压蒸汽灭菌技术。,3.,学习倒平板的方法和两种分离微生物的基本操作技术。,4.,学习微生物纯种分离、培养及菌落的观察。,二,.,实验器材,1.,培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。,2.,牛皮纸等包扎材料。,3.10%HCl,、,10%NaOH,、精密,pH,试纸。,4.,牛肉膏、蛋白胨、,NaCl,、琼脂。,5.,高压蒸汽灭菌锅等。,6.,活性污泥。,7,接种环、酒精灯、恒温箱,(,培养箱,),等。,8,结晶紫染液。,9.,显微镜、载玻片,5-2,三,.,实验内容,（一）培养基的制备及灭菌,1.,玻璃器皿的包扎与灭菌,（,1,）六套培养皿一组,用报纸包装。,（,2,）取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用长报纸条包扎。,（,3,）干热灭菌,:,上述玻璃器皿在,160,C,烘箱内2小时。,2.,无菌水的制备,在3支试管中各装入9,ml,自来水，塞上硅胶塞,同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。,5-3,3.,培养基的制备,称量：,牛肉膏 蛋白胨,NaCl,琼脂 自来水,0.75,g 1.5g 0.75g 3g 150ml,溶化：,用烧杯在电炉上将上述各物依次溶解，注意补充水,。,调,pH,值：,溶液稍冷后用,pH,试纸、10%,NaOH,或10%,HCl,调整溶液 的,pH,在,7.6,左右,。,分装：,试管4支各装其高度1/5的溶液，其余溶液装锥形瓶。,加塞包扎,：,锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。,湿热灭菌：,（高压蒸汽灭菌）,1.05,kg/cm,2,(103kPa),、,121,灭菌,20,min,。,搁置斜面：,试管培养基冷至50,时斜搁使斜面长度不,超过试管一半,。,6-1,（二）微生物的分离、培养及形态观察,1.,平板划线分离法,(1),倒平板,:,将融化并冷至,50,的细菌培养基倒约,1520ml,于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之均匀。冷后成平板。（,3,个）,(2),划线：,在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取一环菌液（原污水）在平板上划线。常用的方法有如下三种：,划线完毕后,盖上皿盖，倒置,于,37,恒温箱中,培养,48,小时后观,察结果。,6-2,2.,稀释平板分离法,(,1),取样,(2),稀释水样 以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管和无菌水将,10,-3,倍的水样稀释至,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,倍。,(3),平板制作 将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓度的水样各吸,0.5ml,于相应的培养皿中。加热融化培养基，待其冷至约,45,时以无菌操作倾注,1015ml,入培 养皿中，马上将培养皿平,放桌上 轻轻转,动使之混合均匀，,冷却后 成平板。,倒置，于,37,培,养,48,小时后观察,结果。,10,-1,10,-2,10,-3,10,-4,10,-5,10,-6,6-4,3,菌落形态特征的观察,观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、透明度、气味及粘滞性等。,4,微生物个体形态观察,在观察了已培养好的各种微生物菌落形态以后，用结晶紫单染色，进行显微镜的观察。并绘制形态图。,5.,斜面接种技术,在培养好的平板上选定一个 典,型的细菌菌落。将接种环在火焰上,灼烧灭菌。以无菌操作法轻轻挑取,少许菌种，迅速将接种环伸进斜面,试管中，在培养基上由底部向顶部,轻轻划线。试管塞好棉塞，在,37,培养,48,小时后观察。,三,.,思考题：,1.,为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高、时间长？,2.,培养基配好后，为什么必须立即灭菌？,3,.,分离活性污泥为什么要稀释水样,?,你考虑怎样来进行生物膜法中生物膜的纯种分离和培养,?,