微生物检验11.pptx

,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,弧菌科,弧菌科,一群菌体短小、弯曲成弧形或直杆状的革兰阴性细菌,兼性厌氧，发酵葡萄糖，许多菌株生长需要2%3%氯化钠,大多数菌株氧化酶阳性,具有一端单一鞭毛、运动迅速,弧菌科细菌广泛分布于自然界，以水中最为多见。其中有一些种对人类致病。,弧菌科(,Vibrionaceae,),弧菌属,（,Vibrio,）,气单胞菌属,（,Aeromonas,）,邻单胞菌属,（,Plesiomonas,）,发光杆菌属（,Photobacterium,）,发光杆菌属主要存在于海水中，对人类不致病,第一节 弧菌属,弧菌属（,Vibrio,）,共有36个种。其中有12个种与人类感染有关,霍乱弧菌,引起霍乱,副溶血弧菌,引起食物中毒,弧菌属,与人类感染有关的弧菌属细菌,霍乱弧菌,O1,群霍乱弧菌（,V.cholerae,O1 group）,O139,群霍乱弧菌(,V.cholerae,O139 group),非,O1,群霍乱弧菌（,V.cholerae,non-O1 group）,副溶血性弧菌(,V.parahaemolyticus,)、,霍利斯弧菌（,V.hollisae,）、,拟态弧菌（,V.minicus,）、,河弧菌（,V.fluvialis,）、,创伤弧菌（,V.vulnificus,）、,溶藻弧菌（,V.alginolyticus,）、,少女弧菌（,V.damsela,）、,麦氏弧菌（,V.metschnikovii,）、,辛辛那提弧菌(,V.cincinnatiensis,)、,弗尼斯弧菌（,V.furnissii,）、,卡佳丽弧菌（,V.carchariae,）,临床意义,主要引起人类腹泻，也可导致肠道外感染如伤口感染、败血症等,氧化酶均阳性,除麦氏弧菌外,能发酵葡萄糖，对弧菌抑制剂,O/129,敏感,钠离子能刺激其生长，有些菌种在无盐条件下不能生长，称为嗜盐菌（,halophilic bacteria）,多数能在血平板或普通琼脂平板上生长，在血平板上可呈现,、,或不溶血菌落。,在肠道选择性培养基上如含乳糖或肌醇的麦康凯平板，许多,致病性弧菌可以生长，形成糖类不发酵的菌落,一、霍乱弧菌,（一）临床意义,霍乱弧菌（,V.cholera,）,是烈性肠道传染病霍乱的病原体,目前有155个血清群,其中,O1,群有古典（,classical）,和埃尔托(,El-Tor),两种生物型,在自然情况下，人类是霍乱弧菌的易感者,自1817年以来，已发生七次世界性的霍乱大流行，均由霍乱弧菌的,O1,群引起,前六次为霍乱弧菌的古典生物型,第七次为埃尔托生物型,自1992年10月起,分离到新的血清群,O139，,现在世界各地均有流行或散发病例报告,致病机制,正常情况下，胃液中的胃酸可消灭食物中的霍乱弧菌,但在胃酸降低时，或摄入大量的霍乱弧菌时，霍乱弧菌可以从胃进入肠道。,进入肠道的霍乱弧菌通过鞭毛运动穿过肠粘膜表面的粘液层，通过菌毛定植于肠粘膜上皮细胞表面繁殖,产生由染色体介导的对热不稳定的霍乱毒素（,cholera toxin,CT）,而致病,O1,群和,O139,群的致病机制和过程是一样的,CT,(cholera toxin),结构基因是,ctxAB,操纵子,由,A,和,B,两个蛋白质亚单位组成,A,亚单位分子量为21 812,Da，,由240个氨基酸组成，在成熟过程中由蛋白水解酶切割成,A1,和,A2,两部分，以二硫键相连,A1,为毒素活性单位，通过,B,亚单位结合细胞膜上,GM1,受体的通道或,“,内吞,”,进入细胞内，激活腺苷酸环化酶（,cAMP,酶），使细胞内,cAMP,大量增加。快速向细胞外分泌水和电解质，使肠腔内水、钠潴留，导致呕吐和腹泻，机体陷于缺水和电解质、酸碱平衡紊乱状态。,B,亚单位分子量为11 677,Da，,由103个氨基酸组成，为5个单体组成中空的寡聚体。与肠粘膜上皮细胞膜上的神经节苷脂,GM1,受体结合,其他致病物质,El-Tor,生物型能产生不耐热溶血素和血凝素,不耐热溶血素,具有溶血活性、细胞毒、心脏毒和致死毒性,El-Tor,生物型的溶血特性可发生变异,血凝素,能凝集鸡红细胞,能被,D-,甘露糖抑制,（二）生物学特性,1.,形态,新从患者标本中分离出的细菌革兰染色阴性，弧形或逗点状,在患者,“,米泔水,”,样便中，可呈头尾相接的,“,鱼群,”,样排列,菌体一端有鞭毛，悬滴观察时呈,“,穿梭,”,样运动,有普通菌毛和性菌毛,O139,群有荚膜,2,.,抗原成分,不耐热的,H,抗原,为共同抗原,耐热的,O,抗原,具有群特异性和型特异性，是霍乱弧菌分群和分型的基础,分型,根据,O,抗原的不同，现有155个血清群,O1,群、,O139,群引起霍乱,O139,血清群的抗原编码基因中出现了36,kb,的新基因,缺少了,O1,群高分子量的,O,抗原侧链,与,O1,群抗血清无交叉反应，但可与,O22,血清群和,O155,血清群产生交叉反应，遗传学特征和毒力基因与,O1,群相似。,O2,群,O138,群血清群,可引起人类的胃肠炎，不引起霍乱流行，称之为非,O1,群霍乱弧菌。,以往也称不凝集弧菌或非霍乱弧菌,O1,群霍乱弧菌的,O,抗原,由,A、B、C,三种抗原因子组成,通过不同组合可形成三个型别,由,AB,组成小川型(,Ogawa),AC,组成稻叶型(,Inaba),ABC,组成彦岛型(,Hikojima),彦岛型的抗原性不稳定，各型之间可以相互转换。以小川型和稻叶型为常见流行型别,3,.,培养特性,营养要求不高，在普通琼脂上生长良好,兼性厌氧。1644均可生长，以37为适宜,具耐碱性，在,pH6.810.2,范围均可生长,在,pH8.29.0,的碱性胨水或碱性平板上生长迅速，其他杂菌被抑制生长,在,pH8.5,的碱性胨水中经3546,h,增菌后可在液体表面大量繁殖形成菌膜,常用的选择性培养基,硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖(,Thiosufale-citrate-salts-sucrose,TCBS),琼脂平板,霍乱弧菌发酵蔗糖产酸，菌落呈黄色,含亚碲酸钾的选择平板有4号琼脂、庆大霉素琼脂,生长并将培养基中的碲离子还原成元素碲,形成灰褐色菌落中心,能在无盐培养基上生长,在血琼脂平板上菌落较大,El-Tor,生物型可形成,溶血环,在含明胶的培养基上,O139,群霍乱弧菌可形成不透明的浅灰色菌落，周围有一圈不透明带，此菌落涂片观察可发现荚膜,4生化反应,氧化酶阳性,发酵蔗糖，动力阳性,赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阴性,可以在无盐培养基上生长,在含有高于6%氯化钠的培养基上不能生长,特,征,古典生物型,El-Tor,生物型,羊红细胞溶血,D,鸡红细胞凝集,+,V-P,试验,+,多粘菌素,B,敏感试验,+,组噬菌体裂解,+,组噬菌体裂解,+,抵抗力,可在河水、井水及海水中存活20天左右,对热、干燥和光敏感；10012,min,即死亡,怕酸耐碱，在正常胃酸中仅能生存4,min,对常用消毒剂敏感，0.5,ppm,氯15,min,能杀死,对庆大霉素耐药,（三）微生物检验,1检验程序,2.标本采集和运送,霍乱是烈性传染病，凡在流行季节和地区有腹泻症状的患者均应快速准确作出病原学诊断,在发病早期，尽量在使用抗菌药物之前采集标本,取患者,“,米泔水,”,样便，亦可采取呕吐物或尸体肠内容物，或采取肛门拭子,标本应避免接触消毒液,采取的标本最好就地接种碱性胨水增菌,不能及时接种者可用棉签挑取标本或将肛门拭子直接插入卡布运送培养基中,送检标本装在密封，不易破碎的容器中，置室温由专人输送,甘油盐水保存液不适合于弧菌的运送,3.标本直接检查,涂片染色镜检,取标本直接涂片，固定染色。油镜观察有无,“,鱼群,”,样排列的革兰阴性弧菌,动力和制动试验,直接取,“,米泔水,”,样便，制成悬滴(或压滴)标本后，在暗视野或相差显微镜下直接观察呈穿梭样运动的细菌。,同法重新制备另一标本涂片，在悬液中加入1滴不含防腐剂的霍乱多价诊断血清(效价1：64)。可见最初呈穿梭状运动的细菌停止运动并发生凝集，则为制动试验阳性。可推定为霍乱弧菌存在,快速诊断,通过直接荧光抗体染色和抗,O1,群抗原的单克隆抗体凝集试验，能够快速诊断霍乱弧菌感染,霍乱毒素的测定,用改良的,ELISA,法，将纯化的,GM1,包被，以俘获标本中的,CT。,或采用乳胶凝集测定,CT，,有较高的灵敏度和特异性,4.分离、培养与鉴定,将标本直接接种于碱性胨水，或将运送培养基的表层接种于碱性胨水中3568,h,后，转种,TCBS,琼脂平板、4号琼脂平板或庆大霉素琼脂平板，351218,h,观察菌落形态,在,TCBS,上形成黄色，4号琼脂或庆大霉素琼脂平板上呈灰褐色中心的菌落，均为可疑菌落,用,O1,群和,O139,群霍乱弧菌多价和单价抗血清进行凝集,结合菌落特征和菌体形态，作出初步报告,鉴定,将血清凝集确定的菌落进一步纯培养，依据全面生化反应，血清学分群及分型进行最后鉴定,符合霍乱弧菌的菌株尚需区分古典生物型和,El-Tor,生物型,对病原性弧菌的主要鉴定试验为赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶,霍乱弧菌和拟态弧菌可在无盐普通肉汤和普通琼脂平板上生长，而其他弧菌则不能,用于霍乱弧菌的鉴别试验,霍乱红试验,霍乱弧菌有色氨酸酶和硝酸盐还原能力。,霍乱弧菌和其他弧菌均有此种反应,粘丝试验（,String Test）,弧菌属细菌除副溶血性弧菌部分菌株外，均有此反应,O/129,敏感试验,O/129,（2，4Diamino6，7Diisopropylpteridine，2，4,二氨基6，7二异丙基喋啶）,10,g,及150,g,纸片周围出现任何大小的抑菌环均为敏感。,O1,群和非,O1,群霍乱弧菌均敏感。,但已有对,O/129,耐药的菌株出现。用此试验作鉴定时，需特别谨慎。需结合其他试验结果如耐盐生长试验等综合考虑,5.抗体检测,可用于霍乱的回顾性诊断和培养不能确定的霍乱病例的辅助诊断,在感染发生后的10天内，特异性的杀菌抗体和抗毒素抗体升高,二、副溶血性弧菌,Vibrio parahaemolyticus,（一）临床意义,具有嗜盐性（,halophilic）,存在于近海的海水、海底的沉淀物、鱼虾类和贝壳及盐渍加工的海产品中,主要引起食物中毒和急性腹泻,是我国沿海地区及海岛食物中毒的最常见病原菌,胃肠炎临床表现有：恶心、呕吐、腹痛、低热、寒战等。腹泻呈水样便，偶尔血性，恢复较快，病程23天，通常为自限性,还可引起伤口感染和菌血症,致病物质,通过菌毛的粘附,毒素,耐热直接溶血素（,Thermostable direct hemolysin,TDH）,分子量为21 000，有2个亚单位组成，能耐受10010,min,不被破坏,溶血毒性，,TDH,对人和兔红细胞的溶血性较高，对马红细胞不溶血,细胞毒性，对多种培养细胞如,Hela,细胞、,FL,细胞、,L,细胞及鼠心肌细胞有细胞毒性,心脏毒性，可导致心电图异常表现如,ST-T,改变、房室传导阻滞、室颤或心跳骤停及心肌损伤,肠毒性，使肠粘膜的毛细血管通透性增高，向肠腔分泌亢进,其结构基因,tdh,也存在于其他致病性弧菌当中,耐热直接溶血素相关溶血素（,Thermostable direct hemolysin related hemolysin,TRH），,生物学特性与,TDH,相似,（二）生物学特性,1.,形态,革兰阴性杆菌，有鞭毛（极单毛），无荚膜，无芽胞,2.,抗原结构,耐热的菌体（,O）,抗原，具有群特征性，副溶血性弧菌的,O,抗原有13种,鞭毛抗原，不耐热，无型特异性,3培养特性,营养要求不高,在无盐培养基上不能生长，最适合生长的氯化钠浓度为3.5%，超过8%不能生长,最适,pH,为7.78.0，但,pH9.5,时仍能生长，最适生长温度为3037,在碱性胨水中经69,h,增菌可形成菌膜,培养特性,TCBS,琼脂平板,:,0.52.0,mm,大小，蔗糖不发酵而呈蓝绿色菌落,普通血平板,:,不溶血或只产生,溶血,从腹泻患者中分离到的菌株95%以上在我妻（,wagatsuma）,琼脂上产生,溶血现象，称为神奈川现象（,Kanagawa phenomenon,KP）,嗜盐性选择平板,:,较大，圆形，隆起，稍浑浊，半透明或不透,明，无粘性,SS,平板,:,扁平，无色半透明，蜡滴状菌落，有辛辣味，不易,刮下，48,h,后牢固粘着培养基上，部分菌株不能生长,麦康凯平板,:,部分菌株不生长,伊红美兰琼脂和中国兰琼脂培养基不能用于本菌的初次分离,抵抗力,抵抗力弱,不耐热，90 1,min,即被杀死,淡水中不超过2日，但海水中能存活47天以上,耐碱怕酸，1%醋酸或50%食醋中1,min,死亡,（三）微生物检验,1.,检验程序,微生物检验,2.,标本采集,:,可采集患者的粪便，肛门拭子和可疑食物。应及时接种，或置碱性胨水或卡-布运送培养基中送检,3.分离培养与鉴定,(1),增菌培养,标本接种1%,NaCl,碱性胨水或4%,NaCl,蛋白胨水,中进行选择性增菌,(2),分离培养,标本直接接种或增菌后接种,TCBS,平板或嗜盐菌,选择平板,TCBS,平板：绿色或蓝绿色菌落，不透明，直径,12,mm,微突起菌落,嗜盐菌选择性平板：较大、圆形、隆起，稍混,浊、半透明或不透明、无粘性菌落,（3）鉴定,氧化酶阳性，,O/129（150g）,敏感,发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸，不发酵蔗糖、乳糖。,吲哚试验阳性,大部分菌株脲酶阴性，,V-P,阴性,NaCl,生长试验,在不含,NaCl,和含10%的蛋白胨水中不生长，在3%和7%,NaCl,蛋白胨水中生长,赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阴性,神奈川现象阳性,毒素测定,用免疫学方法测定,TDH,和,TRH。,用基因探针和,PCR,方法直接测定毒素基因,tdh,或,trh,三、其他弧菌,除霍乱弧菌和副溶血弧菌外，以下弧菌也对人类致病。,1.拟态弧菌（,V.minicus,）,过去认为是蔗糖不发酵的霍乱弧菌,与非,O1,群霍乱弧菌相似,与几种非,O1,群霍乱弧菌,O,抗原有交叉反应,常引起胃肠炎，偶尔可见伤口感染或菌血症,少数菌株可产生,CT、TDH,等毒素。但不引起暴发流行,2.创伤弧菌（,V.vulnificus,）,1976,年首次被认识。在致病性弧菌中，该菌引起的疾病最为严重，引起的菌血症和伤口感染的病程进展非常快而致命。,发酵水杨酸和,ONPG,阳性,感染通常发生在气温较高季节，通过生食牡蛎等海产品，侵入肠粘膜淋巴结和门静脉，侵入血流导致菌血症，死亡率50%,青年人好发，特别是酒精性肝功能损伤或免疫缺陷人，与转铁蛋白有关,引起创口感染，导致蜂窝织炎，偶尔可侵入血流导致菌血症而死亡。,致病机理尚不明确，但产生的胶原酶、蛋白酶和细胞毒素可造成组织严重损害,3.溶藻弧菌（,V.alginolyticus,）,最常见于外耳、中耳感染患者，也常见,于伤口感染,是弧菌属细菌中耐盐性最强的致病菌,4.河弧菌（,V.fluvialis,）,最早从腹泻患者中分离到，全世界均有引起腹泻的报道,1981年被命名，之前被归类为,F,群霍乱弧菌,或,CDC EF6,群,5.弗尼斯弧菌（,V.furnissii,）,该菌很少从粪便中分离到，致病性？,最近报告从腹泻患者中分离到，提示有一定临床意义,6.霍利斯弧菌（,V.hollisae,）,可引起腹泻、创口感染及菌血症,通过食用海产品和接触海水而感染,通常所有的霍利斯弧菌均携带,TDH,基因,7.其他弧菌,麦氏弧菌（,V.metschnikovii,）,氧化酶阴性，引起个别患者菌血症和霍乱样肠炎,可从海产品、鸟类、河水以及污水中分离到,只需微量的钠盐即可生长,辛辛那提弧菌（,V.cincinnatinesis,）,有引起菌血症和脑膜炎的报告,卡佳丽弧菌（,V.carchariae,）,有引起伤口感染的报告,临床意义,临床标本中分离的病原性弧菌都应认为有临床意义,特别是从粪便标本中分离到霍乱弧菌,O1,群、,O139,群和副溶血性弧菌,从任何临床标本分离到创伤弧菌，均应通知临床医师，并根据我国传染病防治法有关规定及时作传染病报告，并将报告和菌种一起报送到各级法定部门。,返回,气单胞菌属和邻单胞菌属,氧化酶阳性，端鞭毛、革兰阴性杆菌、兼性厌氧,根据表型特征，伯杰系统细菌学手册（第一版）将,其归为弧菌科。,根据基因特征，,MacDonell,和,Colwell,建议设立气单胞菌科，而邻单胞菌与肠杆菌科中的变形杆菌属有,更密切的关系。,一、气单胞菌属,（一）分类与命名,气单胞菌属原有四个种：,亲水气单胞菌（,A.hydropila,）,豚鼠气单胞菌（,A.caviac,）,温和气单胞菌（,A.sobria,）,杀鲑气单胞菌（,A.salnonicida,）,杀鲑亚种（,A.salnonicida subsp.salnomicida,）,不产色亚种（,A.salnonicida subsp.achroniogenes,）,杀日本鲑亚种（,A.salnomicida subsp.masoucida,）,分类与命名,根据,DNA,杂交结果,分14个基因种或,DNA,杂交群,(DNA hybridiyation groups,HGs)，,有几个新种名被提出，但很多,DNA,杂交群尚未命名,杀鲑气单胞菌为嗜冷菌，存在于海水中引起鱼类等感染，不引起人类感染。,临床意义,引起肠道内感染,常见5岁以下儿童和成人，夏季腹泻的第二、三位病原菌,临床症状从温和腹泻到严重痢疾样腹泻，成人呈慢性化,主要致病物质为溶血毒素和细胞毒素等,肠道外感染,主要皮肤和软组织感染，主要由亲水气单胞菌和维隆气单,胞菌引起,90%以上菌血症由亲水气单胞菌和维隆气单胞菌引起，通,常发生在免疫低下人群,引起眼部感染、脑膜炎、肺炎、胸膜炎、骨髓炎、关节炎、腹膜炎、胆囊炎、下腔性静脉炎和尿道感染,生物学特征,形态,革兰阴性直杆菌，有时呈球杆状；除杀鲑气单胞菌外均有动力,培养特性,营养要求不高，普通培养基上可生长,TCBS,培养基不生长，在045范围内均可生长,根据生长温度不同可分为,嗜冷菌群,(psychrophilic group)35,以下生长，37不生长,嗜中温菌群（,mesophilic group）1042,之间生长,生化特性,氧化酶和触酶阳性，发酵葡萄糖和其他碳水化合物，产酸或产酸产气，还原硝酸盐。许多菌株在22时的生化反应比37活跃,抗原结构,抗原结构复杂，基因种的血清分型显示出血清学上的异质性。许多抗原结构能在多种细菌中存在,易损气单胞菌和霍乱弧菌,O139,群有交叉反应,检验程序,微生物检验,标本采集,腹泻患者采取粪便或肛门拭子，肠道外感染采集血液、脓液、脑脊液或尿液标本,分离培养,急性腹泻患者的粪便及脓液标本等可直接接种,初次分离常用血平板、,MacConky,平板和加有20,g/ml,氨苄西林素的血琼脂平板,豚鼠气单胞菌在,MacConky,平板上发酵乳糖,嗜水气单胞菌和维隆气单胞菌在血平板中有溶血现象,菌落灰白色、光滑、湿润、凸起、2,mm,大小菌落,SS,平板和,TCBS,平板不适合用于气单胞菌分离,含菌量较少的标本可用碱性胨水进行增菌培养,鉴定,氧化酶、吲哚试验、硝酸盐还原试验、葡萄糖发酵试验,对,O/129,耐药、,TCBS,平板上不生长、在无盐培养基上生长可与弧菌属和邻单胞菌属鉴别,临床常见的亲水气单胞菌和豚鼠气单胞菌均能发酵阿拉伯糖，而其他气单胞菌均为阴性，前者,V-P,和赖氨酸脱羧酶试验阳性，而后者均为阴性。,维隆气单胞菌维隆生物型的特点是鸟氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阳性,二、邻单胞菌属,邻单胞菌属只有一个菌种,类志贺邻单胞菌（,P.shigelloides,）,导致肠胃炎，好发于夏季，通常为散发流行，临,床症状是短时间的水样泻或痢疾样腹泻，患者有进食生水或海产品史。,肠道外感染,:,机体抵抗力下降人群,引起菌血症、脑膜炎。偶尔也可在伤口分泌液、,胆汁、关节液等标本中分离到,类志贺邻单胞菌,革兰阴性直杆菌，成双或短链状排列，25根端极鞭毛，有动力，生长温度845,检验程序标本采集方法同气单胞菌属,血琼脂平板中生长良好，灰色平滑、不透明、大小为1.5,mm,菌落。无溶血，氨苄西林抑制其生长。,在,MacConky,平板上生长，呈乳糖不发酵或迟缓发酵,乳糖菌落,类志贺邻单胞菌,氧化酶、触酶试验、吲哚试验、硝酸盐还原阳性，发酵葡萄糖和其他碳水化合物产酸不产气，,O/129,敏感，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶试验均为阳性及肌醇阳性,TCBS,平板和6%,NaCl,胨水不生长，在不含盐胨水中生长,本菌与肠杆菌科的宋内志贺菌和痢疾志贺菌有交叉血清学反应。志贺菌属氧化酶阴性，动力阴性可以鉴别。,