国标SNT5194-2020羊传染性脓疱皮炎检疫技术规范规范.pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51942020代替 SN/T 11622002羊传染性脓疱皮炎检疫技术规范Quarantine protocol for contagious pustular dermertitis of sheep and goat 中华人民共和国海关总署发 布ICS 11.220CCS B 412020-12-30 发布2021-07-01 实施ISN/T 51942020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国长春海关、中华人民共和国宜兴海关、中华人民共和国惠州海关、
2、吉林省畜牧兽医科学研究院。本文件主要起草人:孟庆峰、周宇、童明龙、王伟利、程荣华、姚贵哲、孟日增、王伟琳、宋战昀。1SN/T 51942020羊传染性脓包皮炎检疫技术规范1范围本文件规定了羊传染性脓疱皮炎临床诊断、病毒分离、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应检测技术。本文件适用于羊传染性脓疱皮炎的检疫检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规程和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求3术
3、语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全,应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行检测,所有培养物和废弃物应按照 GB 19489 中的有关规定执行。5试剂和材料5.1所用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。5.2犊牛睾丸原代细胞的制备(见附录 A 中 A.1)。5.30.01 mol/L(pH7.2)PBS(见附录 A 中 A.2)。5.410%十二烷基硫酸钠(见附录 A 中 A.3)。5.520 mg/mL 蛋白酶 K(见附录 A 中 A.4)。5.6引物与探针根据羊传染性脓疱皮炎特异基因合成一套特异性引物。扩增产物大小为 488 bp。
4、引物 1:5-CGGCGTATTCTTCTCGGACT-3引物 2:5-CGGACAGGTCCTTGACGATG-3根据羊传染性脓疱皮炎特异基因合成一套特异性引物与配套探针。引物 1:5-TGAACCGCTACAACACCT-3引物 2:5-GAGTCCGAGAAGAATACGC-3探针:FAM-AACTTCCACCTCAACCACTCCG-TAMRA2SN/T 519420205.7阳性对照:可溯源的标准毒株,或含目的片段的 DNA 亦可。5.8分子生物学试剂:10PCR 缓冲液、dNTP(2.5 mmol/L)、Taq DNA 聚合酶(5U/L)、ExTaq Hs(5U/L)。5.90.2
5、 mL 和 1.5 mL 塑料离心管。5.10吸头,配套移液器使用。5.11灭菌三角烧瓶:250 mL,500 mL。6仪器和设备6.1PCR 仪。6.2荧光 PCR 仪。6.3电泳仪。6.4凝胶成像系统。6.5生化培养箱:-5 1 50 1。6.6生物安全柜。6.7电子天平:感量 0.1 g。6.8均质器。6.9生物显微镜。6.10移液器:量程 0.5 L10 L,量程 10 L100 L,量程 100 L1 000 L。6.11高速冷冻台式离心机(最高可达 13 000 r/min)。7临床诊断7.1临床症状临床症状主要分唇型、蹄型及外阴型,见附录 B 中 B.1。7.2剖检变化主要病变见
6、附录 B 中 B.2。7.3流行病学主要流行病学见附录 B 中 B.3。7.4初步诊断根据临床症状、剖检变化、流行病学做出初步诊断。8病毒分离8.1样品处理采集疑似患病羊痂皮脓疱等病料,加 0.01 mol/L(pH7.2)PBS 研磨制成 110(质量体积)的悬液,5 000 r/min离心30 min,取上清液,按20%比例加入浓度为10 000 IU/mL的双抗(青、链霉素),4 感作过夜后,保存备用。3SN/T 519420208.2样品接种培养犊牛睾丸原代细胞长满 25 cm2细胞培养瓶单层后,弃上清营养液,接种病料处理上清液 l mL,37 吸附 2 h,弃上清液后加入含 2%血清
7、的 MEM 细胞维持液,37 静止培养,同时设正常细胞对照及感染细胞对照。每天观察细胞生长情况和细胞病变(CPE)。若细胞在接种病料后 4d5d 内未出现病变则连续盲传 3 代后收取培养物;若有 CPE 出现,直接收取培养物。8.3结果鉴定8.3.1对照细胞正常,接种样品的细胞盲传 3 代后无 CPE,判为阴性。8.3.2细胞初期出现小病灶,病灶中的细胞圆缩,有折光性。进一步培养,CPE 增多,所有细胞脱壁。经过连续传代后可在 24 h48 h 后产生完全的 CPE。8.3.3出现上述典型 CPE 的培养物,用 PCR 和荧光 PCR 进行进一步鉴定。9PCR 检测方法9.1模板 DNA 的制
8、备取待检样品 8.1 上清液 465 L,加入 25 L 10%十二烷基硫酸钠和 10 L 的 20 mg/mL 蛋白酶 K,50 水浴摇床上放置2 h;加入等量的饱和酚溶液500 L,振荡混匀20 s,12 000 r/min离心5 min,取上清液;加入等体积的酚三氯甲烷异戊醇(25241),振荡混匀 20 s,12 000 r/min 离心 5 min,取上清液;再加入等体积的三氯甲烷异戊醇(241),振荡混匀 20 s,12 000 r/min 离心 5 min,取上清液;最后加入两倍体积的无水乙醇,上下颠倒混匀,12 000 r/min 离心 10 min,弃上清液,室温干燥后,加入
9、 50 L 双蒸馏水溶解沉淀,既得 DNA 模板,-20 贮存备用。另外,DNA 提取也可采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒,按照说明书进行操作。9.2反应体系反 应 体 系 为 25 L:10PCR 缓 冲 液(Mg2+Plus)2.5 L、dNTP(2.5 mmol/L)2.0 L、引 物(25 mol/L)各 1 L、Taq DNA 聚合酶(5U/L)5 L、模板 DNA 1 L、ddH2O 补足 25 L。9.3反应条件94 预变性 3 min;94 变性 30 s,56 退火 30 s,72 延伸 40 s,进行 40 个循环;72 延伸 10 min,4 保存。9.4结果观察用
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