SNT5224-2019出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法实时荧光PCR内标法国家标准规范.pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 522420192019-12-27 发布2020-07-01 实施中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署发 布ICS 07.100.30X04出口食品中单核细胞增生李斯特菌检验方法实时荧光 PCR 内标法Detection of Listeria monocytogenes in food for exportReal-time PCR with internal amplification control methodISN/T 52242019前 言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则进行起草。本标准由中华人民共和国海关总署
2、会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国杭州海关、上海交通大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:李可、施春雷、王娉、史贤明、方莹、张晓峰、崔妍。1SN/T 52242019出口食品中单核细胞增生李斯特菌检验方法 实时荧光 PCR 内标法1范围本标准规定了出口食品中单核细胞增生李斯特菌的实时荧光 PCR 内标方法。本标准适用于出口食品中单核细胞增生李斯特菌的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.30-2016 食品安全国家标
3、准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3定义、术语和缩略语下列定义、术语和缩略语适用于本文件。3.1定义和术语3.1.1 扩增内标 internal amplification control,IAC扩增内标()是指添加到 PCR 反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建 DNA 序列或者是一段致病菌的看家基因序列。主要原理是:在荧光定量 PCR 中使用与目的基因相似的扩增内标,它的两端引物结合序列与目的基因完全一致,但具有不同的探针
4、结合序列,使之不能与目的基因的探针结合,只能与内标探针结合。将扩增内标添加到 PCR 反应体系中,使之与目标基因序列共同进行扩增,如果在反应体系中存在一些抑制因素,则扩增内标和目标序列的扩增都将受到抑制,从而达到指示 PCR 反应假阴性的目的。3.1.2 Ct值 cycle threshold Ct每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.2缩略语PCR(polymerase chain reaction):聚合酶链反应。DNA(deoxyibonuleic acid):脱氧核糖核酸。FAM(6-carboxyfluorescein):6-羧基荧光素。HEX(6-hexachl
5、orofluorescein):6-羧基-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素琥珀酰亚胺酯。2SN/T 522420194方法提要荧光 PCR 反应体系中,预先加入能同时扩增目标片段和扩增内标的引物,以及目标菌探针、内标检测探针以及内标质粒,然后将样品 DNA 加入 PCR 反应液中进行两步法荧光 PCR 反应,在扩增内标质粒与样品 DNA 的共同扩增中如果存在抑制现象,扩增内标的 PCR 扩增也将被抑制,从而达到对样品的荧光 PCR 检测过程进行假阴性监控目的。5试剂除另有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯,实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容
6、器分装。5.1DNA 提取试剂:DNA 提取液:20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,1.2%Triton X-100(pH 8.0),也可使用商业化的 DNA 提取试剂。5.2Taq DNA 聚合酶。5.3dNTP 混合液。5.410PCR 缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4),200mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2。5.5引物和探针:见附录 A。5.6内标质粒:参见附录 B。6主要仪器和设备6.1恒温水浴锅或加热套装置:100。6.2恒温培养箱:36 1,30 1。6.3离心机:最大转速 13 000 r/min 以
7、上。6.4天平:感量 0.1 g。6.5冰箱:-20 4。6.6均质器。6.7可调移液器:1 L-1000 L。6.8荧光 PCR 仪。7检验程序食品中单核细胞增生李斯特菌的扩增内标荧光 PCR 检测流程见图 1。图 1 食品中单核细胞增生李斯特菌检验程序3SN/T 522420198操作步骤8.1 样品制备、增菌培养按照 GB 4789.30-2016 中第一法进行样品制备和增菌(两次增菌)。8.2 细菌模板 DNA 的制备取 8.1 中培养的二次增菌液 1 mL,加到 1.5 mL 无菌离心管中,8 000 r/min 离心 5 min,吸弃上清液;加入 50 L DNA 提取液(使用前室
8、温解冻并充分混匀,快速吸取),混匀后沸水浴 10 min,置冰上 10 min;12000 r/min 离心 5 min,取上清保存于-20备用以待检测。也可采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒并按其说明制备模板 DNA。8.3 荧光 PCR 检测8.3.1 荧光 PCR 反应体系荧光PCR反应所用引物和探针见附录A,PCR反应体系见表1。也可采用商品化的PCR扩增体系。每个 DNA 样品做 2 个平行管。加样时应使样品 DNA 溶液完全落入反应液中,不要粘附于壁上,加样后尽快盖紧管盖。表 1 PCR 反应体系组分工作液浓度加样量 L终浓度10PCR 缓冲液-2-dNTP Mixture(10
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