DB41∕T 1515-2017 猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法.pdf
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1、ICS 65.020.30B 41DB41河南省地方标准DB 41/T 15152017猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 检测方法2017 - 12 - 06 发布2018 - 03 - 06河南省质量技术监督局发 布河南省地方标准公共服务平台DB41/T 15152017I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局归口。本标准起草单位:河南省动物疫病预防控制中心,郑州市畜牧技术推广站,焦作市动物疫病预防控制中心,驻马店市动物疫病预防控制中心、开封市动物卫生监督所、郑州市中心医院。本标准主要起草人:崔沛、班付国、闫若潜、曹伟伟、马震原、陈悦、王淑娟。本标准参加起草人
2、:王英华、谢彩华、王翠、王华俊、赵胜杰、赵明军、王东方、郭育培、张敏、杨晴、张煜、刘先敏、靳冬、刘淑敏。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 151520171猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 检测方法1范围规定了猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 检测的试剂和仪器设备,样品采集、处理、存及运输,操作方法、结果判定。适用于对疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、血液,精液,流产胎儿、死胎、木乃伊胎等样品中病毒核酸的检测。2试剂和仪器设备2.1试剂2.1.1除另有规定外,所用生化试剂均为分析纯。提取 RNA 所用试剂应使用无 RNA 酶污染的容器进行分装。2.1.2组织悬液(见附录 A),-20保存。2.1.
3、3裂解液(TriZol),氯仿,1核酸电泳缓冲液,0.01 mol/L(pH 7.2)的 PBS(见附录 A),DEPC处理水(见附录 A),以上试剂 4保存。2.1.4组织样品悬液常规试剂(见附录 A)常温保存。2.1.5裂解液(TriZol),氯仿, 0.01 mol/L(pH 7.2)PBS(见附录 A),DEPC 水(二乙基焦碳酸酯处理的水),均应 2 -8保存。2.1.6异丙醇,75 %乙醇,应-20 保存。2.1.7阳性对照样品、阴性对照样品见附录 A。2.1.8RT-PCR 扩增用上、下游引物序列见附录 B。2.1.9猪乙型脑炎病毒 RT-PCR 试验反应混合液组成、说明及使用注
4、意事项参见附录 C。2.2仪器设备PCR 扩增仪,高速冷冻离心机(离心转速在 12 000 rmin-1 以上),核酸电泳仪和水平电泳槽,恒温水浴锅,生物安全柜, 组织匀浆器,2 8 冰箱,-70 冰箱,单道微量移液器(0.1 L2.5 L;0.5 L10 L;2 L20 L;20 L200 L;100 L1 000 L)凝胶成像系统(或紫外透射仪),真空干燥器。3样品的采集、处理、存放及运输3.1样品的采集河南省地方标准公共服务平台DB41/T 1515201723.1.1采取疑似猪乙型脑炎病毒感染的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎及公猪精液等靶组织样品,装入灭菌 1.5 mL 离心管中,编
5、号,送实验室。3.2样品的处理3.2.1组织样品处理:取 100 mg 待检样品,按 1 :5 倍体积加入 PBS,于研钵或组织匀浆器中充分研磨,1 000 r/min 离心 15 min,取上清液,转入 1.5 mL 离心管中编号备用。3.2.2血清样品的处理: 用无菌注射器自耳静脉采集血液 1-2 mL, 把血清析出后直接转入新的无菌 1.5mL 离心管中,编号备用。3.3存放与运输采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实验室。样品在 2 8 条件下保存应不超过 24 h;若超过 24 h,应放置低于-20冰箱,不宜反复冻融。4操作方法4.1样品 RNA 的制备4.1.1
6、取 1.5 mL 灭菌离心管,每管加入 300 L 裂解液,然后分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各 100 L,吸头反复吸打混匀(一份样品换用一个吸头);再加入 100 L 氯仿,充分颠倒混匀(不宜过于强烈);于 4条件下,12 000 r/min 离心 15 min。4.1.2吸取离心后各管中的上清液 150 L 转移至新的 1.5 mL 灭菌离心管中 (注意不要吸出中间层) ,加入 150 L 20 预冷的异丙醇,颠倒混匀,室温放置 15min。4.1.34条件下 12 000 r/min 离心 15 min (离心管开口保持朝离心机转轴方向放置) 。 轻轻倒去上清,将灭菌离心
7、管倒置于吸水纸上, 吸干液体, 不同无菌离心管应置于吸水纸不同地方沾干。 加入 1 mL 75 %乙醇,轻轻颠倒洗涤。4.1.44条件下 12 000 r/min 离心 5 min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液,将灭菌离心管倒置于吸水纸上,吸干液体,不同无菌离心管应在吸水纸不同地方吸干。4.1.54条件下 12 000 r/min 离心 30 s,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不应触及沉淀,真空抽干 3 min5 min 或室温干燥 10 min。不宜过于干燥,以免 RNA 不易溶解。4.1.6加入 11 L DEPC 处
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