液相色谱实验步骤和方法开发PPT课件.ppt

液相色谱的应用以及方法开发提纲：一一.HPLC.HPLC的广泛应用的广泛应用二二.方法开发过程方法开发过程 一）选择一）选择HPLCHPLC检测器检测器 二）分配色谱及选择流动相二）分配色谱及选择流动相 三）方法开发的具体步骤三）方法开发的具体步骤 四）梯度洗脱方法四）梯度洗脱方法一.HPLC的广泛应用 据2004年统计，世界上化合物总数多达4700多万种在全部有机化合物中仅有20左右的样品适用于GC分析而HPLC可对80左右的有机化合物进行分离和分析HPLC的广泛应用 HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备 在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力。HPLC的应用领域在食品研究中的分析应用在食品研究中的分析应用食品中的天然成分食品中的天然成分碳水化合物类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸食品添加剂食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素维生素污染物污染物霉菌（黄曲霉毒素农药残留和兽药残留多环芳烃（PAHS和亚硝酸HPLC的应用领域 在医药研究中分析应用在医药研究中分析应用 药物分析有药物分析有USPUSP、BPBP、CPCP等标准等标准 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。管药、磺胺类消炎药等。甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。素和孕激素等。抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。四环素、氯霉素、诺氟沙星等。中草药研究中的应用：生物碱、甙类中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙皂甙、强心甙、黄酮甙等等)、萜类、萜类手性药物手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂如解毒剂D-D-青霉青霉胺毒性小，胺毒性小，L-L-异构体毒性很强异构体毒性很强)医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。v 在兽药研究中分析应用在兽药研究中分析应用HPLC 的应用领域 在生物化学和生物工程中的应用在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)在精细化工分析中的应用在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析醇、醛和酮、醚的分离分析酸和酯的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究聚合物的分析研究药物、农药、染料、炸药等工业产品药物、农药、染料、炸药等工业产品HPLC的应用领域化妆品行业要控制和分析：化妆品行业要控制和分析：防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；在公安、刑警破案工作需要在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等投毒药物、毒品分析等在环境污染分析中的应用在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测类和胺类的检测 在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析 二.方法开发的过程Adapted from:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;Practical HPLC Method Development 2nd Ed.,Wiley-Interscience,New York,1997,p.21.1.得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标得到样品信息，确定分离目标2.2.确定特定确定特定确定特定确定特定HPLCHPLC过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求过程、样品预处理等的需求3.3.选择合适的检测器选择合适的检测器选择合适的检测器选择合适的检测器4.4.选择选择选择选择HPLCHPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件方法；初步分离；建立最佳分离条件5.5.优化分离条件优化分离条件优化分离条件优化分离条件6.6.检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要检查特定过程的问题及需要7.7.定量校正定量校正定量校正定量校正8.8.日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认日常使用的确认第一步干什么?想办法得到各种信息想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法品的分析方法查文献和方法，如查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-CA,AA,AOAC,EPA-仪器制造商的文献，如仪器制造商的文献，如Dionex,WatersDionex,Waters对色谱柱有足够的了解对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品充分了解您自己的样品分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析有多少组份要分析?对分析的精确度、准确度等有多高要求对分析的精确度、准确度等有多高要求?是否因是日常检验，而要求方法容易使用是否因是日常检验，而要求方法容易使用?分离(制备)时要了解哪方面的情况？要分离（即制备）的样品量有多大要分离（即制备）的样品量有多大?要分离的组份在样品中的含量很高要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量还是微量?是否需要保持生物活性是否需要保持生物活性?对分离产物纯度的要求有多高对分离产物纯度的要求有多高?纯度或活性的鉴定如何完成纯度或活性的鉴定如何完成?使用文献方法注意点色谱柱填料的种类、品牌是否相同色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相注意文献方法的流动相是否损害色谱柱是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量需要调整流速、进样量注意梯度条件注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）了解系统的滞后体积（梯度）一）选择HPLC检测器对样品有响应并有一个输出信号对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系但是：但是：由于受由于受HPLCHPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象度之间关系的与线性偏离现象并不是所有的检测器是线性的并不是所有的检测器是线性的受受HPLCHPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可能系统其他部件的影响，检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距与其最佳水平有较大的差距用于HPLC的检测器没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！色谱分离！HPLCHPLC检测器可以分为：检测器可以分为：溶质性质检测器（选择型）溶质性质检测器（选择型）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）动相的变化（选择型）整体性质检测器（通用型）整体性质检测器（通用型）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）化作出响应（通用型）理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略的基线噪音高灵敏度；可忽略的基线噪音宽的线性范围宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速等变化不敏感对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性长时间操作的稳定性低死体积低死体积非破坏性非破坏性选择性选择性灵敏度：信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（的比值（S/NS/N）检测限（检测限（LODLOD）：）：S/N=3S/N=3定量限（定量限（LOQLOQ）：）：S/N=10S/N=10好的信噪比有利于：好的信噪比有利于：更好的色谱峰确认更好的色谱峰确认更好的定量更好的定量更好地完成色谱峰纯度更好地完成色谱峰纯度/均一性均一性6:1NS选择液相色谱的检测器要考虑的因素：要考虑的因素：你要分离的化合物你要分离的化合物/样品的化学特性样品的化学特性化学结构、分子量及紫外光谱等等化学结构、分子量及紫外光谱等等流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）梯度还是等度梯度还是等度灵敏度需求灵敏度需求是否有双检测的需求是否有双检测的需求选择液相色谱的检测器通用检测器 RI ELSD MS灵敏度ugngpg线性范围104否103流速敏感是否是温度敏感是否否破坏性否是是选择性检测器 ABSFLEC Cond MS灵敏度ngpgfgpgpg线性范围105103106105103流速敏感否否是是是温度敏感否否是是是破坏性否否是否是吸光度（UV/Vis）检测原理原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：比耳定律，定量基础：比耳定律，A AKCLKCL优点：优点：1 1）对温度和流速不敏感）对温度和流速不敏感 2 2）可用于梯度洗脱）可用于梯度洗脱 3 3）灵敏度较高，灵敏度较高，ngng级检测级检测缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质吸光度（UV/Vis）检测的应用大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器 -多数公司售出的检测器中75%以上是吸光度检测器（其中50%以上是紫外/可见检测器，25%是PDA）背景吸收的影响背景吸收降低背景吸收降低了线性范围了线性范围多数流动相有多数流动相有紫外吸收紫外吸收实际浓度浓度理想10吸光度吸光度210背景吸收背景吸收背景吸收背景吸收光电二极管矩阵（Photo Diode Array）Photo Diode ArrayPhoto Diode Array简称：简称：PDAPDA或或DADDAD光电二极管矩阵检测器（PDA）的特点和用途 一种三维水平的吸光度检测器-采集三维谱图 兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息在收集色谱图的同时，得到光谱图 提供许多有用的功能 -色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 -可以发现单波长检测时未测到的峰 -任意波长的色谱再处理 -光谱信息-光谱库的建立检索和拟合 荧光（Fluorescence）检测原理 原理：发荧光的化合物吸收光（原理：发荧光的化合物吸收光（UVUV或或VISVIS）使其分子达到激发态，当其返回到基态时发使其分子达到激发态，当其返回到基态时发射光的现象即荧光射光的现象即荧光优点：荧光检测器灵敏度高优点：荧光检测器灵敏度高,pg,pg级检测级检测缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生要衍生 荧光检测器原理荧光检测器的应用 环境中的污染物环境中的污染物多环芳烃多环芳烃(PAH)(PAH)，多，多酚，氨基甲酸酯等酚，氨基甲酸酯等 食品、饮料食品、饮料食品中的毒素；例食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素如：黄曲霉毒素染料染料维生素及衍生氨基维生素及衍生氨基酸酸 生物技术及制药生物技术及制药氨基甲酸酯类杀虫剂黄曲霉毒素多环芳烃（PAH）维生素示差折光（Refractive Index）检测示差折光检测器（示差折光检测器（RIRI）是第一个商品化的液相色）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）通常被认为是一种通用检测器通常被认为是一种通用检测器检测溶液中所有被溶解的溶质检测溶液中所有被溶解的溶质 非特异性非特异性任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值与真空中的速度之比值R RS S 示差折光（RI）检测 的原理原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样 各组分浓度。各组分浓度。优点：通用型检测器优点：通用型检测器缺点：缺点：1 1）对温度变化敏感）对温度变化敏感 2 2）不能用于梯度检测）不能用于梯度检测 3 3）灵敏度低，）灵敏度低，ugug级检测级检测返回示差检测器的应用示差折光检测器是通用型检测器,如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例如糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等高分子化合物GPC,GFC分析以及复杂样品纯化二）色谱基本分类色谱基本分类：色谱基本分类：按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为：按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为：1.1.分配色谱分配色谱分配系数分配系数*2.2.亲和色谱亲和色谱亲和力亲和力 3.3.吸附色谱吸附色谱-吸附力吸附力 4.4.离子交换色谱离子交换色谱离子交换能力离子交换能力 5.5.凝胶色谱（体积排阻色谱）凝胶色谱（体积排阻色谱）-分子大小引起的体积排阻分子大小引起的体积排阻分配色谱分配色谱分为：分配色谱分为：正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性 反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性。反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性。用得最多，约占用得最多，约占60-70%60-70%相对应的色谱柱：相对应的色谱柱：反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如C18C18（ODSODS）C8,C4,C3C8,C4,C3，苯基等，苯基等 正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为-CN-CN氰基，氰基，-NH2-NH2氨基等氨基等分配色谱的分离机理分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱流动相极性流动相洗脱强度反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：水水 甲醇甲醇 乙腈乙腈 乙醇乙醇 丙醇丙醇 异丙醇异丙醇 四氢呋喃四氢呋喃 最常用的流动相组成最常用的流动相组成“甲醇甲醇-水；乙腈水；乙腈-水水”正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：正己烷正己烷 乙醚乙醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 5%/ml5%/min2.5 ml/min-2%/ml流出顺序变化-一个梯度洗脱现象迁移距离10 cm开始25 cm保留时间(min)柱长化合物 A化合物 B10 cm14.215.325 cm18.217.9 k 和有机改性剂百分含量之间的关系 -等梯度条件(n.b.k为对数坐标)梯度洗脱过程中的迁移Ghost Peaks0%MeOH100%梯度洗脱的实际考虑对于下列应用，梯度洗脱可能不适合:使用强保留添加剂的应用.离子对色谱应用 在裸硅胶柱上的正相HPLCBlank run producing ghost peaks due toimpure water.正确的柱长是多少?在允许的时间内获得最大分离:分析时间短-短柱，高流速 分析时间长-长柱，正常流速结论充分用已知样品结构确定以哪种方法开始充分用已知样品结构确定以哪种方法开始普通反相普通反相?离子抑制离子抑制?离子对离子对?还是其他还是其他观察流动相条件改变时色谱峰的移动观察流动相条件改变时色谱峰的移动根据变化的方向及大小决定下一步干什么根据变化的方向及大小决定下一步干什么改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！色谱柱的改变影响最大色谱柱的改变影响最大梯度洗脱有利于复杂样品的分离梯度洗脱有利于复杂样品的分离开发液相色谱方法的考虑因素分离度是色谱分离中主要考虑的因素分离度是色谱分离中主要考虑的因素除除分分离离度度之之外外，在在开开发发色色谱谱方方法法时时，以以下下几几个个因因素也都要考虑：素也都要考虑：灵敏度灵敏度载样量载样量分析速度分析速度溶剂损耗溶剂损耗成本成本容易使用容易使用色谱柱寿命色谱柱寿命效率效率