急性白血病原代细胞TGF.docx

急性白血病原代细胞TGF
【摘要】 转化生长因子β及其受体的基因突变已被证实在肿瘤形成中具有重要的作用，在许多肿瘤中都发现有TGF-βⅡ型受体表达异常或表达缺失。为了了解急性白血病患者TβR-Ⅱ基因是否存在异常，本研究应用大范围RT-PCR的方法分段扩增急性白血病原代细胞TβR-Ⅱ的编码序列，并结合序列测定技术，分别对6例急性白血病患者以及11例正常人TβR-Ⅱ的编码序列进行突变检测。全部患者经骨髓细胞形态检查符合FAB诊断标准且骨髓原始细胞≥90%。肝素抗凝骨髓4-5 ml，分离单个核细胞，用TRIZOL试剂提取总RNA，反转录后行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。回收目的片段，克隆到PGEM-T载体，进行序列的测定。结果显示：在检测的病人中有2例病人中存在TβR-Ⅱ的同种型，而此2例病人临床预后不良。结论：部分白血病病人存在TβR-Ⅱ的同种型，而且该同种型可能与预后有关。
【关键词】 急性白血病
　　Identification of the Isoform in Type Ⅱ Receptor of Transforming Growth Factor-beta in Patients with Acute Leukemia and Its Clinical Significance
Abstract Recent research indicates that TGF-β and type Ⅱ receptor (TβR-Ⅱ) play an important role in the pathogenesis of tumor. A high frequency of abnormalities in TβR-Ⅱ has been demonstrated in various　identify the mutation of TβR-Ⅱ in patients with acute leukemia，the bone marrow samples from 6 patients with acute leukemia and 11 normal individuals as control were detected by long-range　detect a deletion in sequence of the TβR-Ⅱgene，the PCR products were cloned to T vector and then　results showed that there was existance of the isoform of TβR-Ⅱ in 2 cases out of 6 patients with acute　two patients had more poor prognosis than　conclusion，there was the isoform of TβR-Ⅱ in partial patients with acute leukemia，and the isoform may be related with prognosis.
　　Key words acute leukemia; TβR-Ⅱ; isoform receptor
　　TGF-β信号转导通路在调节多种细胞的增殖与分化、诱导细胞凋亡等方面具有重要的作用，有研究表明这一通路的紊乱可以导致多种肿瘤的发生［1］ 。TGF-β受体有3种亚型即TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ和TβR-Ⅲ，其中TβR-Ⅱ和TGF-β具有较高的亲和力，在TGF-β介导的信号转导中起着重要的作用，在许多肿瘤如慢性淋巴细胞白血病、人类表皮T细胞淋巴瘤患者中［2-3］均观察到TβR-Ⅱ表达缺陷。目前对于急性白血病原代细胞是否存在TβR-Ⅱ缺陷未见报道。本研究通过应用大范围RT-PCR技术分段扩增急性白血病原代细胞 TβR-Ⅱ的编码序列，进行序列的测定，结合收集的病人的临床资料，初步探讨TGF-βⅡ型受体在急性白血病发病机制中所起的作用。
　　材料和方法
　　研究对象
　　实验组6例，男5例，女1例，平均年龄47±岁，为2003年4月-2004年2月福建医科大学附属协和医院血液科住院或门诊白血病病人，均为初治患者，其中急性淋巴细胞白血病2例，急性非淋巴细胞白血病4例按FAB分型诊断明确，其骨髓原始细胞≥90%。正常对照组11例，男9例，女2例，年龄28±岁，均为健康供髓者。
　　单个核细胞的制备
　　采集骨髓，以肝素抗凝。加入37℃温浴的2%甲基纤维素(华美公司产品)至其终浓度为%，混匀，于37℃、5% CO2 培养箱中静置30分钟，吸取上层有核细胞层，铺于Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液上层，室温667×g离心20分钟，吸取中间层细胞置于1/15 PBS，充分重悬，室温167×g离心5分钟，弃上清，重复用PBS洗涤2次，用所得细胞提取RNA。
　　细胞总RNA提取
　　采用TRIZOL提取总RNA，具体操作步骤详见说明书，经紫外分光度计测定浓度和纯度，A260/A280达到，电泳可见清晰的28s及18s两条带，提示RNA结构完整，-70℃保存备用。
　　逆转录反应
　　反应体系25 μl，内含细胞总RNA 2 μg，M-MLV200 U，dNTP 20 nmol，RNasin 25 U，随机引物　μg，5×逆转录缓冲液5 μl。37℃温育60分钟，95℃ 5分钟终止反应，-20℃保存备用。
　　PCR反应
　　反应体系25 μl参照文献[4］，采用高保真酶。扩增条件：95℃预变性5分钟，后94℃变性50秒，62℃退火30秒，72℃延伸60秒，共35个循环，再72℃延伸10分钟。PCR引物由上海博雅公司合成。TβR-Ⅱ 5’ 端编码序列(TGR5)上游引物为 5’ -CTCGGTCTATGACGAGCAG-3’；下游引物为5’-ACGTGGAGCTGATGTCAGAG-3’，扩增产物片段为720 bp。TβR-Ⅱ 3’ 端编码序列(TGR3)上游引物为 5’-CTGCCCATTGAGCTGGACAC-3’；下游引物为5’-CTCCAGCTCACTGAAGCGTTCTG-3’，扩增产物长度902 bp。
　　PCR产物纯化及测序
　　回收PCR产物按割胶回收试剂盒说明书进行，将回收产物5 μl加适量溴酚蓝及水点样电泳，电压5 V/cm，电泳30分钟后，在紫外检测灯光下，可见相应位置有条带。纯化产物连接至T载体上，将所连接产物转化感受态大肠杆菌JM-109细胞，用牙签挑取数个白色菌落，采用PCR方法鉴定，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳可见目的基因扩增带，挑取该菌落加5 ml含氨苄的LB液体培养基，37℃振摇过夜。取1 ml含氨苄的LB液体培养基，送上海博雅公司进行DNA测序。
　　结 果
　　分段扩增TβR-Ⅱ编码序列的PCR结果
　　PCR扩增目的基因，在902和720 bp处可见目的基因条带。
　测序结果
　　检测TβR-Ⅱ编码序列，在所检测的6例病人中有2例病人的TβR-Ⅱ 5’ 端编码序列在相同位置有一长75 bp序列一致的插入片段，在对照组均未检测到存在同种型(图2、3）。
病人TGF-βⅡ型受体5′端编码序列结果如下
　　病人临床检测结果
　　所检测的6例病人，编号为2、4号的2例病人存在TβR-Ⅱ同种型，其初治时的白细胞数较其他病人高，缓解期短，生存期短(随访日期截止2005年4月1日)，其中1例病人入院血常规检查：WBC 350×109/L，入院后48小时死于脑出血。 of 6 patients with acute leukemia
　　讨 论
　　TGFβⅡ型受体是分子量为70-80 kD跨膜糖蛋白，由信号肽、胞外区、疏水跨膜区和胞内参与信号转导的具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的区域组成，其中胞外区可分为3部分：N-端、富含Cys的中心区和近跨膜区。在TGF-β信号转导通路中，活化的TGF-β或者直接结合TβR-Ⅱ或者通过β-多聚糖间接结合TβR-Ⅱ，形成TGFβ/TβR-Ⅱ复合物，从而与TβR-Ⅰ结合并导致TβR-Ⅱ自身的磷酸化，通过这一磷酸化的过程将信号由胞外转导至胞内，从而发挥其抑制细胞增殖、诱导细胞分化或凋亡的作用［6］，由于TGF-β需与TβR-Ⅱ结合才能发挥其抑制细胞生长和促进细胞分化的功能，因此TβR-Ⅱ被视为新的抑癌基因。研究表明，在许多肿瘤中存在TβR-Ⅱ的改变，主要表现为水平下降、基因突变或功能丧失，使得肿瘤细胞失去对TGF-β的反应性，如在胰腺癌、胆管癌［7］中存在 TGFβⅡ型受体水平下调，在结肠癌［8］中TGFβⅡ型受体发生突变，导致功能失活，肿瘤细胞因此失去对TGFβ的反应性。在血液系肿瘤方面，国外有报道，在人类慢性粒细胞白血病与慢性淋巴细胞白血病中存有TβR-Ⅰ或TβR-Ⅱ的缺陷，人类表皮T细胞淋巴瘤细胞中TβR-Ⅱ处于失活状态［2，3］，而在鼠急性红白血病细胞株中TβR-Ⅱ突变可能致使细胞失去对TGF-β1的反应性［9］，但有关其在人类急性白血病中是否存在异常未见报道。
本研究检测6例急性白血病病人和11例健康供髓者发现2例病人TβR-Ⅱ编码序列在相同的位置插入一个75 bp序列相同的片段，经同源性分析后发现，含有这一片段的TGF-βⅡ型受体序列被日本学者Nikawa［5］命名为TβR-Ⅱ同种型，在急性白血病的表达未见相关报道。存在TβR-Ⅱ同种型的病人，1例为52岁男性，经骨髓象、细胞免疫分型诊断为：急性B淋巴细胞白血病，经2个疗程标准方案化疗获得缓解，但2个月后复发，再经2个疗程标准方案化疗获缓解，但1个月后复发，经多次化疗未获缓解死于肺部细菌、霉菌二重感染；另1例为30岁男性，经骨髓象、细胞免疫分型诊断为：急性粒细胞白血病，入院时合并左颞枕叶和右顶叶出血、DIC，在入院后48小时因颅内出血死亡。在未检出变异体的4例病人中，3例经1疗程化疗即获缓解，1例经2疗程化疗获缓解，余情况详见附表。而且由附表可见，在所检测的6例病人中，含同种型的病人初治时的白细胞数也较其他病人高。本研究中所发现插入片段位于TβR-Ⅱ的N-端，这一插入不仅使得N-端多出25个氨基酸，而且将插入点氨基酸由缬氨酸变为天冬氨酸。有报道认为［10］，N-端与TGF-β的结合无关，但Pepin等［11］发现，TβR-Ⅱ的N-端抗体可以阻止TGF-β与TβR-Ⅰ的结合。因此我们推测，所插入片段不影响TGFβ/TβR-Ⅱ复合物的形成，但可能致使该复合物与TβR-Ⅰ的亲和力下降，从而导致TβR-Ⅱ磷酸化受影响，由于TβR-Ⅱ自身磷酸化是信号转导所必需的，因此其受影响就使得细胞失去TGF-β对其的负调控作用，细胞大量增殖，并促进肿瘤细胞的耐药。
【参考文献】
　　1Blobe GC，Schiemann WP，Lodish HF. Role of transforming growth factor beta in human　Engl J Med，2000; 342:1350-1358
　　2Rooke HM，Vitas MR，Crosier PS，et　TGF-beta type Ⅱreceptor in chronic myeloid leukemia: analysis of microsatellite regions and gene ，1999; 13:535-541
　　3Kadin ME，Cavaille-Coll MW，Gertz R，et　of receptors of for transforming growth factor beta in human T-cell　Natl Acad Sci USA，1994; 91:6002-6006
　　4萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南. 第三版.北京：北京科学出版社，2002：35-38
　　5Nikawa　cDNA encoding the human transforming growth factor beta receptor suppresses the growth defect of a yeast ，1994;149:367-372
　　6Lin HY，Wang XF，Ng-Eaton E，et　cloning of TGF-beta type Ⅱ receptor，a functional transmembrane serine/threonine ，1992; 68:775-785
　　7Goggins M，Shekher M，Turnacioglu K，et　alterations of the transforming growth factor beta receptor genes in pancreatic and biliary　Res，1998; 58:5329-5332
　　8Grady WM，Myeroff LL，Swinler SE，et　inactivation of transforming growth factor receptor Ⅱ in microsatellite stable colon　Res，1999; 59:320-324
　　9Machida H，Ogawa K，Funaba M，et　expression of type I and type II receptors for activin，transforming growth factor-beta，and bone morphogenetic protein in the murine erythroleukemic cell line， Eur J Endocrinol，2000; 143:705-110
　　10Hall FL，Benya PD，Padilla SR，et　growth factor-beta type-II receptor signalling: intrinsic/associated casein kinase activity，receptor interactions and functional effects of blocking antibodies. Biochem J，1996; 316 ( Pt 1):303-310
　　11Pepin MC，Beauchemin M，Plamondon J，et　analysis of the extracellular domain of the TGF-beta receptor type　Biophys Res Commun，1996; 220:289-293