学术讨论—胞浆蛋白核蛋白膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞).docx

胞浆蛋白/核蛋白/膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞)(Catalog #DBI-1021 ; DBI-1022; Store kit at 4)描述:本试剂盒提供了蛋白抽提试剂A，蛋白抽提抽提试剂B，蛋白抽提试剂C三种具有独特组分的缓冲液。所有试剂采用PIPES缓冲系统。通过实验，可以得到：细胞胞浆蛋白（其中含有含有可溶性的骨架蛋白）；细胞膜蛋白（其中包含细胞质膜蛋白和细胞器膜蛋白）；细胞核蛋白；其最后剩余的沉淀为难溶性的胞质骨架和纤维蛋白。提取方法简单，可靠，快速。获得的各种部分蛋白纯度高，可用于PAGE电泳、Western Blot、免疫共沉淀、EMSA等后续研究。该试剂盒所得到的蛋白溶液适合用Bradeford法（DBI生物产品：DBI-1045,1046）蛋白定量和BCA方法（DBI生物产品：DBI-1047,1048）进行定量。II 试剂盒组分:III.蛋白质抽提步骤:A. 注意事项和试剂准备: 打开试剂盒后，于4度保存蛋白抽提液；于-20度保存蛋白酶抑制剂，样品缓冲液（6）。 使用前, 加10ul的蛋白酶抑制剂于1ml蛋白抽提试剂A中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix A)；加2ul的蛋白酶抑制剂于200ul蛋白抽提试剂B中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix B)；加2ul的蛋白酶抑制剂于200ul蛋白抽提试剂C中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix C)；试剂盒组分DBI-1021 DBI-1022 包装50 次100 次颜色蛋白抽提试剂A蛋白抽提试剂A-1蛋白抽提试剂B蛋白抽提试剂C混合型蛋白酶抑制剂(100)SDS-PAGE 样品缓冲液(6)50ml500ul50ml25ml1支5支100ml1000ul100ml50ml1支10支棕色棕色棕色棕色棕色绿色 在试验过程中确保抽提混合物始终保存在在碎冰中。 需要自己提供的试剂：90% acetone，PBS抽提所使用的蛋白抽提试剂使用量抽提步骤. 准备细胞1. 将培养好的细胞用预冷的PBS 清洗2-3 次。2. 选择合适的方法进行悬浮细胞和贴壁细胞的蛋白抽提：如果样品为悬浮细胞；蛋白抽提试剂的使用量依赖于培养细胞的湿重或细胞数量。a) 转移悬浮细胞培养液到一个预先称重的离心管中，简单的离心。b) 弃去上清培养基，称量其重量，计算出悬浮细胞的重量。c) 按照实验II 进行下面的实验。如果样品为单层贴壁细胞： 蛋白抽提试剂的使用量取决于培养细胞的器皿大小或细胞数量。a) 按照实验III 进行下面实验。. 悬浮细胞蛋白抽提实验步骤1. 吸取取5 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂A ，加入到已经清洗好的细胞沉淀中。用移液器小心吹打，使细胞悬浮。2. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10 分钟。使95-100%的细胞胞浆流出细胞。注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。3. 以480g 的离心速度，4 度离心10 分钟。4. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（ 标记为上清1）。于-70保存该样品。.5. 吸取取3 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。6. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约30 分钟。7. 以5000g 的离心速度，4 度离心10 分钟。8. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。（标记为上清2）。于-70保存该样品。9. 吸取取1.5 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂C，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。. 漩涡混合器上高速振荡30 秒，或转移到玻璃匀浆器中高速匀浆30 秒。10. 以6780g 的离心速度，4 度离心10 分钟。11. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。（标记为上清3）。于-70保存该样品。. 单层贴壁细胞的蛋白抽提对于贴壁细胞，用细胞刮将细胞刮掉，用PBS 清洗细胞3 次。600g，离心5 分钟，收集细胞。下面实验适用于约5106 个细胞。1. 吸取取1ml 的蛋白抽提试剂A，加入到已经清洗好的细胞沉淀中。用移液器小心吹打，使细胞悬浮。2. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10 分钟。使95-100%的细胞胞浆流出细胞。注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。3. 以480g 的离心速度，4 度离心10 分钟。4. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（ 标记为上清1）。于-70保存该样品。.5. 吸取取500ul 蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。6. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约30 分钟。7. 以5000g 的离心速度，4 度离心10 分钟。8. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。（标记为上清2）。于-70保存该样品。9. 吸取250ul 蛋白抽提试剂C，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀悬浮。. 漩涡混合器上高速振荡30 秒，或转移到玻璃匀浆器中高速匀浆30秒。10. 以6780g 的离心速度，4 度离心10 分钟。11. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。（标记为上清3）。于-70保存该样品。. 蛋白浓度测定可使用BCA 定量法（DBI-018）和Bradford(DBI-016)进行蛋白浓度测定。具体程序请参照相关说明书。该试剂盒所获的的相关部分蛋白质是进行后续实验的最佳蛋白来源。1. 该试剂盒所获的的相关部分蛋白质浓度很高，可以用相关的缓冲液进行稀释使用，因此最大限度的避免了去垢剂的影响。2. 该试剂盒中的蛋白抽提试剂可以和各种蛋白酶抑制剂混合使用，而不影响其抽提效果。3. 利用该试剂盒所得到的蛋白抽提液以成功用于SDS-PAGE，WB，EMSA，IP 等各种实验，蛋白抽提试剂中的去垢剂完全不影响实验。内容总结（1）胞浆蛋白/核蛋白/膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞)(Catalog #DBI-1021（2）Store kit at 4)描述:本试剂盒提供了蛋白抽提试剂A，蛋白抽提抽提试剂B，蛋白抽提试剂C三种具有独特组分的缓冲液（3） 使用前, 加10ul的蛋白酶抑制剂于1ml蛋白抽提试剂A中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix A)