第八章生产有用物质.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第八章 植物细胞培养,及次生代谢产物生产,植物细胞培养是指单个细胞或小细胞团的培养,第一节 悬浮培养,悬浮培养,：是指将单个细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术,一、初始培养细胞来源,1.植物组织细胞作为细胞来源,（1）用机械分离细胞,叶片研碎过滤离心净化细胞,缺点：,只适于细胞排列疏松，细胞间接触点少的叶片组织。,分离细胞产量及活性低。,（2）酶解法分离细胞,叶片果胶酶液处理过滤离心净化细胞,缺点：由于细胞分化程度的差异，细胞的生理一致性较差，影响培养效果。,2.愈伤组织作为初始细胞来源,（1）将,未分化、易散碎的愈伤组织转移到液体培养基中，并置于摇床上80-100r/min振荡培养，获得悬浮细胞液,（2）孔径200,m,筛网过滤，除去大块细胞团；离心，,除去小碎片。,（3）先后用孔径60100,m,和2030,m,筛网过滤,净化细胞；离心，获得单细胞。,优点：,分离方法简单适用,如果为进行快速繁殖；或为原生质体分离及基因转化提供大量材料，往往用胚性,愈伤组织进行悬浮培养,二、悬浮培养的方法,一般按每克鲜重10ml培养基的比例接种。,培养初期，每3 天继代一次，120r/m摇床震荡培养。,悬浮细胞系稳定后，12周继代一次,悬浮液,:,新鲜培养继=1,:4 1,:10,，震荡80120r/m,成功的细胞悬浮系,：培养物分散性好，均匀一致，并且生长迅速,第二节 单细胞培养,悬浮培养流动性大，无法对某个细胞定点观察和分析。,在进行细胞株（种子细胞）选择及需要跟踪观察细胞活动的情况下，采用单细胞培养。,培养方法：,一、细胞平板培养,似原生质体培养,二、看护培养,是指利用生长的愈伤组织所产生的物质来滋养需培养的细胞,三、微室培养法,将单细胞培养在人工制造的微室中的少量培养基中，使其分裂增殖形成细胞团,可用石蜡油等制作微室的“围墙”,优点：,培养过程可连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全过程记录下来,第三节 培养物的次级代谢,一、培养植物细胞生产有用物质的意义,有些植物药用价值很高，但栽培困难，产品价格昂贵，可以利用培养方法生产其中有效成分。,例如，人参，有补元气、安神益智等药效，其药效成分为皂苷等。人参栽培困难，产品短缺，价格昂贵。因此，可以利用人参的细胞培养来生产皂苷。,二、利用培养细胞生产有用物质的原理,细胞全能性,有关细胞全能性，每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢、应激性和自体复制等生命基本属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。,生产的有用物质实际上是利用培养细胞新陈代谢产生的次生代谢物质。,三、培养物的次级代谢及其调节,通常植物代谢分为初生代谢和次生代谢。,植物初生代谢及其产物,是维持细胞生命活动所必需的，初生代谢受阻会直接影响植物的生长和发育,次生代谢及其产物,一般并非生命活动所必需,次级代谢产物,是依植物种不同产生的一些特殊物质，如烟草中产生的生物碱等。,（一）、初级代谢对次级代谢的调节,初级代谢许多重要中间产物是次级代谢的,始点。所以初级代谢能调节次级代谢。,（二）、次级代谢的酶促调节,如同功酶等能调节次级代谢,（三）、环境条件对次级代谢的调节,1、培养基成分,（1）基本,培养基,其营养成分一方面满足细胞生长量的增长，另一方面促使细胞合成和积累次生产物。,一般增加 N、P、K 的浓度能促进细胞生长，适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。,（2）激素,激素的种类、浓度和配比可影响细胞的生长及次生产物的合成。并且不同植物细胞产生不同次生产物，适宜的激素不同。,如烟草组织培养中，2,4-D严重抑制尼古丁合成，而激动素(KT)则有促进作用。,在东北红豆杉细胞培养中，添加一定浓度2,4-D可显著提高细胞生长速度，增加细胞生长量；适当浓度的 BA 和 KT 可提高紫杉醇的积累。,2、光,光，尤其紫外光通常刺激许多培养物形成某些次级产物。,其作用机理，可能光诱导酶的合成，来调节DNA的翻译和转录。,3、温度、氧气,温度和氧气也能够调节次级代谢方向及产量。,如低温导致油菜愈伤组织类脂中不饱和脂肪酸-亚麻酸增加。而在旱金莲愈伤组织类脂中，低温导致亚油酸增加。,四、培养周期,（一）、培养周期的概念,具有一定起始培养密度的细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程，称为,一个培养周期,。,1、延迟期,2、直线生长期（对数生长期）,3、减缓期,4、静止期,（二）、培养周期中各个时期的特点,1、,延迟期,：细胞很少分裂或刚刚开始分裂。,2、,直线生长期（对数生长期）,：细胞数目迅速增长，生长速率保持不变。,3、,减缓期,：细胞数目的增长速度减缓。,4、,静止期,：细胞分裂停止，细胞数目恒定。,培养基中营养耗尽，必须进行继代培养。否则细胞会出现死亡或生活力下降,。,（三）、生长周期中的不平衡生长,1、细胞分裂可能与干重和蛋白质的含量增加不平衡。,2、代谢的方式一直处于不断的变化中。,生长期,，细胞数增长最快，而细胞的干重和蛋白质含量增长较慢。,进入静止期之前,，细胞数增长减慢，而细胞鲜重和干重增长超过了细胞数的增长，并一直持续到静止期。,第四节 利用细胞培养生产 有用物质,一、利用细胞培养生产有用物质的一般程序,（一）选材,选材时，应注意以下条件：,（1）药效肯定,（2）对其有效成分有充分的了解,（3）选取自然状态下能够积累次生产物部位的细胞,（4）市场短缺或价格昂贵的植物，如人参,（5）,（对其）,有测定有效成分和药理的可靠方法,（二）、细胞株系建立,在工厂化生产中，为了提高有用物质产品的产量和质量，对细胞培养的选择有两个基本要求：,（1）有用物质的合成积累能力强,（2）生长速度快,起始细胞应选择自然状态下能够积累次生产物的器官、组织。直接分离细胞，首先诱导产生愈伤组织再分离细胞（前述，以为好），建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）。,在培养过程中，要经常检测培养细胞的生化合成能力，筛选合成能力高的细胞株系，并不断更新细胞株系。,(三）、大量培养（规模培养）,将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产“种子”，进行规模化培养。,用生物反应器进行培养,（四）、产品提取与纯化,从植物细胞培养物中提取和纯化有用的产品。,二、提高有用物质生产效率的技术因素,（一）、筛选高产细胞系,从实验材料中筛选高产的细胞株系是提高生产率、降低生产成本的重要因素。,Wayner等用柠檬叶、鸡眼藤的培养物，经过筛选细胞株系，其次生代谢物是该植物完整植株的10倍。,Zenk从长春花的培养物中，筛选出高产细胞株系，其生产根碱和阿玛碱的总量，比亲本植物高1.5倍，是亲本植物根含量的5倍。,特异的次生代谢产物往往是特异的器官中形成的。因此，用特异器官为材料，建立特异功能的细胞系，并从中反复多代培养选择有效的、高产的细胞株。,筛选出的高效、高产细胞株系，有的植物细胞系其高效、高产性能稳定多年，但有的植物细胞系不稳定，因此，还需要定期检测，更新细胞株系。,（二）、二步培养法,自然条件下，一般植物生长不活跃的部分，如老叶、果实和种子，倾向于积累次生代谢物，而分生组织等快速生长的部分，次生代谢物的含量低。,植物离体培养下，一般脱分化的细胞生长旺盛，很难积累次生物质。当细胞接近于衰老时，才趋向于积累次生代谢物质。,细胞生长与次生物质的产生对培养基与培养条件的要求不同,细胞工厂化培养中采用二步培养方法，既使细胞生长快，又使次生物质代谢多。,第一步，解决生物量生产,（促进细胞分裂）；,第二步，促进次生代谢物合成,在细胞周期静止期前后更换培养基，有利于次生物质的积累。,（一部分细胞用于提取物质，另一部分用于继续培养，进行下一个细胞周期）,（三）、培养基中添加前体,前体：有用次生代谢物的前驱物。,烟草愈伤组织培养中，将前体物质烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。,前体物质的加入时间非常重要，应注意。,（四）、培养基中生长调节剂（激素）的作用,植物及次生代谢产物不同，所需激素不同,植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化与再分化，而且能影响次生代谢物质的产生。,如烟草愈伤组织培养中，培养基中添加吲哚乙酸（IAA），能合成烟碱，而在含有2,4-D的培养基上，烟碱合成受阻。,（五）、培养条件的影响,光照、温度等影响次生代谢。,在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。,（六）、采用固相细胞培养系统,细胞生长分裂旺盛时，次生代谢物产量低。,采用固相培养，将细胞培养在惰性基质中，细胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。,四、若干有用物质的生产,（一）、生物碱,许多生物碱已经用作医学上的药物。如吗啡等生物碱通常从鸦片中提取，用作神经麻醉剂，利用罂粟种子的愈伤组织培养，可提取吗啡碱及其它生物碱。利用长春花愈伤组织培养，也能生产多种生物碱。,（二）、苷类物质,利用人参愈伤组织培养生产皂苷已进入工厂化生产。,（三）、醌类物质,利用紫草、决明等愈伤组织培养，生产具有抗细菌活性的醌类物质。,（四）、蛋白质,1、酶制剂,菜豆悬浮细胞,培养液,中，检查到有过氧化酶等多种酶类物质，且活性较高。,2、胰岛素,商品胰岛素多数从动物的胰脏提取，但价格昂贵。从苦瓜离体培养物种可提取胰岛素。,3、氨基酸,从聚合草愈伤组织中可提取L-谷氨酰胺，而且含量比植株叶子高260倍。,（五）、食品添加剂,1、色素,如何利用植物色素，将是未来食品工业的重要课题。,单冠毛菊的愈伤组织，可提取红色的花色素；葡萄细胞培养，可获得花色素和苷色素；甜菜和菠菜培养，可获得甜菜苷。,2、芳香油、香精,芳香油一般是在植物的特殊结构中合成的。,据研究，黄菊、鸡冠紫苏、淡红色荷蔷薇等植物的培养细胞能合成芳香油，并可从愈伤组织中提取之。并且鸡冠紫苏的培养细胞能合成香精。,3、调味剂,甜菊的愈伤组织中可提取甜味剂,长春花的培养细胞能生产磷酸二酯酶，作为调味品。,（六）、农药,从除虫菊的愈伤组织中可提取除虫菊酯。,除虫菊是一种特别有效的杀虫剂。虽然人工可以合成拟除虫菊酯，但昆虫会逐渐产生抗性，且污染环境。,五、存在问题,植物细胞培养生产有用物质尽管有种种优点，但与微生物培养比还存在许多问题。,1、,植物细胞培养时，其生长速度较慢,。通常完成一次生产周期需45周才能完成；而微生物的工业发酵只需几天就可完成发酵全过程。,2、,植物细胞培养生产次生代谢物的总量一般比植物本身低，,这主要是由于大多数离体培养细胞不能合成和积累所期望的物质，当然也有些细胞株系产量高，这与微生物大不相同。,3、,生产技术上还存在一些问题,。培养过程需要复杂的培养基及附加物，且易受细菌、真菌的污染；次生物的产量不甚稳定，成本较高等,