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细胞生物学实验报告
细胞骨架组分的荧光染色观察

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一、实验原理
鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。
由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白,因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. 此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用。因此,用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。

二、实验目的
1．掌握细胞骨架的显示方法
2.掌握荧光显微镜的使用方法
3.了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构

三、实验器材
1.材料：
CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞
2.试剂：
PEM：50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇
0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液。4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液。
3.仪 器
超净工作台、CO2培养箱、荧光显微镜
4.其它用品：
盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿、试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、废液缸。

四、方法与步骤
由于上节课鸡胚成纤维细胞被污染，本次实验所用细胞为CHO细胞
（1）准备好实验器材。（本次实验无需在超净台中进行）
（2）将上节课进行细胞爬片的培养皿从培养箱中取出，取出盖片，于小平皿中。
（3）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)
（4）Triton X-100处理约10min(1mL)
（5）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)
（6）37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min (1mL)
（7）37℃预温 PEM洗3次
（8）55nM Alex -phalloidin 10µL湿盒中室温染色30min。（避光）
（9）在parafilm 膜上加PEM ，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。
（10）37℃预温 PEM洗数3次，滴加10µL Ho.33342复染色。
（11）荧光显微镜下观察并拍照。

五、注意事项
1.盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻。
2.注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；
3.各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；
4.荧光观察注意避光操作，防止荧光淬灭。
5.节约试剂。

六、实验结果 
本次实验我们对CHO细胞爬片结果进行了荧光染色，在荧光显镜下用不同波长的激发光对细胞骨架微丝结构及细胞核进行了观察、拍摄照片并将结果叠加。得到以下的实验现象：

图1.CHO细胞微丝荧光染色图

图2.CHO细胞核荧光染色图

图3.CHO细胞微丝及细胞核荧光染色合成图
从拍摄的照片可以较为清晰的看到CHO细胞骨架的微丝被染成了绿色，细胞核被染成蓝色；微丝的形状为长条的纺锤状细丝，遍布整个细胞，在细胞中起到了类似骨架般的支撑作用；细胞核为椭圆形，之后再将两图合成，可观察到细胞核被遍布的微丝结构包围。实验较为成功。在实验时要注意荧光染料均存在淬灭问题，所以要尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。每步洗涤要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀释下一步的抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。

【参考文献】
[1] 桑建利, 谭信. 细胞生物学实验指导. 北京:科学出版社, 2010.
[2] 北京师范大学生命科学学院.细胞生物学实验.北京:北京师范大学生命科学学院,2015.9.