细胞培养方法.pptx
《细胞培养方法.pptx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《细胞培养方法.pptx(52页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、细胞培养细胞培养理论课:理论课:第一部分第一部分细胞培养基本知识细胞培养基本知识李李松松第二部分第二部分细胞培养室的设置、细胞培养用液细胞培养室的设置、细胞培养用液李李松松第三部分第三部分细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术卿卿晨晨博士博士第四部分第四部分正常组织细胞的培养正常组织细胞的培养李李松松第五部分第五部分 肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养杨继红杨继红博士博士 第六部分第六部分组织培养技术和应用组织培养技术和应用卿卿晨晨博士博士杨继红杨继红博士博士实验部分:参观实验室实验部分:参观实验室培养细胞的观察培养细胞的观察培养细胞生长曲线的绘制培养细胞生长曲线的绘制 第一章第一章细胞培养基本知识细胞培
2、养基本知识组织培养工作始于本世纪之初(组织培养工作始于本世纪之初(Harrison1907,Carrel1912)组织培养、细胞培养、器官培养组织培养、细胞培养、器官培养组织细胞培养的主要优点:组织细胞培养的主要优点:(1 1)研究的对象是活的细胞;研究的对象是活的细胞;(2 2)研究的条件可控制;研究的条件可控制;(3 3)研究的样本可以达到均一性;研究的样本可以达到均一性;(4 4)研究的内容便于观察、检测;研究的内容便于观察、检测;(5 5)研究的范围比较广泛;研究的范围比较广泛;(6 6)研究的费用相对较经济。研究的费用相对较经济。细胞培养存在的不足:细胞培养存在的不足:(1)组织或细
3、胞与体内相应者仍然存在差异;组织或细胞与体内相应者仍然存在差异;(2)细胞培养存在一定的不稳定性也是其缺点之一;细胞培养存在一定的不稳定性也是其缺点之一;(3)细胞培养对人员、设备等条件都要求较高。细胞培养对人员、设备等条件都要求较高。研究的内容:研究的内容:(1)细胞与细胞之间的相互作用。细胞与细胞之间的相互作用。(2)细胞内部与细胞外界之间的作用。细胞内部与细胞外界之间的作用。(3)细胞内胞质的活动。细胞内胞质的活动。(4)胞质与胞核之间流动。胞质与胞核之间流动。应用领域:应用领域:1病毒学病毒学利用培养的细胞可获得大量病毒以产生疫苗及鉴定。利用培养的细胞可获得大量病毒以产生疫苗及鉴定。2
4、免疫学免疫学杂交瘤一单克隆抗体技术。杂交瘤一单克隆抗体技术。3遗传学遗传学 可以利用细胞培养技术进行染色体分析。细胞遗传学。可以利用细胞培养技术进行染色体分析。细胞遗传学。4肿瘤学肿瘤学细胞培养技术已广泛应用于肿瘤的研究和治疗。细胞培养技术已广泛应用于肿瘤的研究和治疗。5分化及发育分化及发育6细胞毒试验细胞毒试验7临床医学及生物技术方面的应用临床医学及生物技术方面的应用一、培养细胞的特性一、培养细胞的特性(一)、培养细胞的生长方式及类型(一)、培养细胞的生长方式及类型1贴附生长型细胞:贴附生长型细胞:上皮细胞型:上皮细胞型:其生长特点为细胞之间紧密相靠、其生长特点为细胞之间紧密相靠、互相衔接,
5、具有连接成片能力。互相衔接,具有连接成片能力。成纤维细胞型:其生长特点为细胞一般并不紧靠相成纤维细胞型:其生长特点为细胞一般并不紧靠相连成片,而是排列为漩涡状、放射状。连成片,而是排列为漩涡状、放射状。2.悬浮生长型细胞:不需要附着于底物即可生长,肿悬浮生长型细胞:不需要附着于底物即可生长,肿瘤细胞及部分正常细胞瘤细胞及部分正常细胞(二)、培养细胞的生长特点二)、培养细胞的生长特点1贴附贴附细胞接种后细胞接种后510min可见细胞以伪足初期附着,接着可见细胞以伪足初期附着,接着细胞逐渐伸展开,细胞体的中心部分亦随之变为扁平。细胞逐渐伸展开,细胞体的中心部分亦随之变为扁平。2接触抑制及密度依赖性
6、接触抑制及密度依赖性细细胞胞生生长长汇汇合合成成一一片片时时,其其分分裂裂增增殖殖停停止止,这这种种生生长特性即为密度依赖性调节。长特性即为密度依赖性调节。转转化化细细胞胞或或癌癌瘤瘤细细胞胞则则接接触触抑抑制制下下降降,他他们们互互相相之之间可在上面或下面经过而重叠生长。间可在上面或下面经过而重叠生长。(三)、培养细胞的生长过程(三)、培养细胞的生长过程1单个细胞的生长过程:细胞周期单个细胞的生长过程:细胞周期 细胞周期细胞周期=间期间期+M期期=G1期期+S期期+G2期期+M期期G1期:期:DNA合成前期,为下一步合成前期,为下一步DNA复制和蛋白质合成复制和蛋白质合成作准备。作准备。S期
7、:期:DNA合成期。本期的细胞活动主要为合成期。本期的细胞活动主要为DNA的合成。的合成。G2期:期:DNA合成后期。合成后期。M期:有丝分裂期。期:有丝分裂期。2细胞系(细胞系(cellline)的生长过程:)的生长过程:原代培养(原代培养(primaryculture):):传代期(传代期(subculture):):衰退期:衰退期:3每代细胞的生长过程每代细胞的生长过程滞留期:一般细胞滞留期约为滞留期:一般细胞滞留期约为2496h。指数生长期:此期细胞增殖旺盛,成倍增长,适用于指数生长期:此期细胞增殖旺盛,成倍增长,适用于进行实验研究。持续进行实验研究。持续35d。平台期:平台期:二、培
8、养细胞生长的条件二、培养细胞生长的条件(一)、细胞的营养需要(一)、细胞的营养需要1基本营养物质基本营养物质:包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子。包括氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子。2促生长因子:血清中含有多种上述细胞生长所需的物促生长因子:血清中含有多种上述细胞生长所需的物质。质。3其它条件其它条件:温度:温度:需在保持一定恒温,适宜的温度与取材的动物种类有关。高温比低温对细胞的影响细胞更为明显。气相:气相:多数细胞需要有O2条件下才能生长,氧张力通常维持在略低于大气状态,体外培养细胞其气体环境一般应为95%空气加CO2的混合气体。pH:适于在pH 7.27.4条件下生长,一般来
9、说,偏酸的条件比偏碱的环境对生长有利。渗透压:渗透压:人类血浆的渗透压约为290m mol/L,多数培养细胞对渗透压有一定范围的耐受能力。无污染及无毒:无污染及无毒:微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染。第二章第二章细胞培养室的设置和准备工细胞培养室的设置和准备工作作一、细胞培养实验室的设置及设备一、细胞培养实验室的设置及设备(一)、(一)、细胞培养实验室的设置细胞培养实验室的设置细胞培养实验室应能进行:无菌操作、孵育、细胞培养实验室应能进行:无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。1无菌操作区无菌操作区(1)无菌操作室)无菌操作室(2)净化工作台)净化
10、工作台侧流式或称为垂直式;外流式侧流式或称为垂直式;外流式或称为水平层流式。或称为水平层流式。(3)无菌操作箱)无菌操作箱2孵育区孵育区3制备区:进行培养液及有关培养用液等的制备。制备区:进行培养液及有关培养用液等的制备。4储藏区储藏区5清洗和消毒灭菌区清洗和消毒灭菌区(二)、细胞培养实验室设备(二)、细胞培养实验室设备1常用的基本设备常用的基本设备(1)显微镜:)显微镜:倒置显微镜(2)培养箱:)培养箱:恒温培养箱及CO2培养箱(3)干燥箱:)干燥箱:(4)水纯化装置:)水纯化装置:培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水。(5)冰箱:)冰箱:(6)细胞冷冻储存器:)细胞冷冻储存器:(7)离心机:)
11、离心机:(8)消毒器:)消毒器:(9)滤器:)滤器:(10)各类培养用器皿:)各类培养用器皿:培养器皿、培养瓶、多孔培养板、吸管、加样器等。2特殊设备特殊设备:酶联免疫检测仪、超低温冰箱、流式细胞仪等。二、培养用品的清洗和消毒灭菌二、培养用品的清洗和消毒灭菌(一)、培养用品的清洗(一)、培养用品的清洗1清洗清洗(1)浸泡:)浸泡:在5%稀盐酸溶液中浸泡过夜,以中和其碱性物质。(2)刷洗:)刷洗:(3)清洁液浸泡:)清洁液浸泡:由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成,浸泡6h以上。2.冲洗冲洗(二)、培养用品的消毒灭菌(二)、培养用品的消毒灭菌1消毒灭菌的方法消毒灭菌的方法(1)干热消毒)干热消毒(
12、2)湿热消毒)湿热消毒(3)紫外线消毒:)紫外线消毒:(4)过滤除菌消毒:)过滤除菌消毒:血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。微孔滤膜滤器:微孔滤膜滤器:有孔径为0.6m、0.45m、0.22m三种滤膜,注意滤膜的正面(光面)应向上。(5)消毒剂及抗菌素:)消毒剂及抗菌素:抗菌素的应用是为了预防,不能依赖抗菌素来达到消毒灭菌。常用的抗菌素为青霉素及链霉素。2消毒方法的选择消毒方法的选择实验室中空气的消毒,过滤、紫外线消毒、电子灭菌灯。实验室的消毒,最常用的是以酒精擦拭,亦可以紫外线照射。培养器械的消毒:干热或湿热消毒、消毒剂浸泡或紫外线照射。培养用液体的消毒:高压蒸汽消毒、过
13、滤方法除菌。第三章第三章细胞培养用液及培养基细胞培养用液及培养基一、培养用液一、培养用液1水水水为细胞培养所必需,在组织细胞培养中用水必须非常纯。2平衡盐溶液平衡盐溶液维持渗透压、调节pH值,供给细胞所需的能量和无机离子成分。主要作为合成培养基(液)的基础液及用于洗涤组织、细胞等。平衡盐溶液主要以无机盐及葡萄糖配制而成。各种平衡盐溶液的主要不同点在于氯化纳的浓度、离子的浓度及缓冲系统不同。3消化液消化液(1)胰蛋白酶液:)胰蛋白酶液:常用浓度为0.25%,配制时应用不含Ca2+、Mg2+和含血清的液体。(2)EDTA(二乙烯四乙酸二钠)液:(二乙烯四乙酸二钠)液:EDTA是一种化学螯合剂,主要
14、作用在于能吸取Ca2+、Mg2+,使细胞分离,常用浓度为0.02%,用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解。(3)胶原酶:)胶原酶:二、二、培养基培养基(一)、天然培养基(一)、天然培养基1血清血清小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清以及人血清等,血清虽是常用的天然培养基,对绝大多数细胞的生长有利,某些成份可能对细胞有害。2血浆血浆3组织浸出液组织浸出液4水解乳蛋白水解乳蛋白(二)、合成培养基(二)、合成培养基合成培养基给细胞提供了一个近似体内生存环境,又便于控制和标准化的体外生存环境。1合成培养基基本成分合成培养基基本成分氨基酸:氨基酸:以必需氨基酸为主,细胞仅能利用氨基酸的L型同分异构体。细胞对
15、谷氨酰胺之有较高的要求。维生素:维生素:糖类:糖类:培养基中的碳水化合物包括葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠等。无机离子:无机离子:培养基含有平衡盐液中的钾、钠等无机盐,有些培养基含有微量元素,如Fe2+、Zn2+、Ca2+等。其它成分:其它成分:三磷酸腺苷、辅酶A、2-硫基乙醇、植物血凝素等。2常用的合成培养基常用的合成培养基(1)199培养液:培养液:是Morgan、Morton及Parker等人在1950年为培养鸡胚细胞研制的。(2)Eagle培养液培养液:由Parker首先备制,Eagle等根据胞质内的氨基酸及维生素的含量比基本培养液中大15倍,配制了最低必需培养液(Eaglesmin
16、imumessentialmedium,MEM)。又改良研究制成了BME(BasalEagleMedium)和DMEM(DulbeccoMEM)。(3)RPMI1640培养液:由Moor等研究成功,不仅肿瘤细胞而且很多正常组织细胞可用。(4)Ham培养液:Ham首先备制,将其命名为F7,后改良为F10,F12培养基,这种培养基特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。3无血清培养基无血清培养基基础培养液:基础培养液:以HamF12和DMEM最为常用。辅加成分:辅加成分:(1)培养基质:)培养基质:主要目的是帮助细胞附着贴壁。常用的培养基质有:纤维连结素(fibronectin)、多聚赖氨酸(poly
17、-lysine)、胶原。(2)营养成分:)营养成分:主要目的是补加各种不同细胞生长所需以及已知血清中促进细胞生长的物质。(3)酶抑制剂:)酶抑制剂:目的是替代血清的保护作用。第四部分第四部分正常组织细胞的培养正常组织细胞的培养不同组织细胞和器官的结构功能、生长特性不同,在体外培养中所需要的分离方法和生长条件也不同。一、上皮细胞的培养一、上皮细胞的培养许多器官的上皮细胞具有特定的功能。上皮细胞在体外培养中需要从表皮分离、培养液和基质选择、增加适当的生长因子。(一)、表皮细胞(一)、表皮细胞表皮细胞生长在胶原基膜上,并从基膜获取生长分化所需要的物质。在体外培养情况下,可用胰蛋白酶消化法使表皮与真皮
18、分开。原代或有限表皮细胞需要使用某些基质、培养液及包括滋养层在内的一些添加物。在正常Ca2+浓度情况下可形成分化的复层生长细胞,在低Ca2+浓度下,则呈未分化单层细胞生长;有充足滋养细胞时,有助于减少混杂的成纤维细胞。1用品用品(1)培养液)培养液(1)含有4倍浓缩维生素及氨基酸的EaglesMEM,加有热灭活的15%FCS。(2)与上相同的4MEM,加无Ca2+的HBSS,用CaCL2调整Ca2+浓度为0.08mmol/L,用于人表皮细胞时则为0.22mmol/L。(3)FAD培养液,其组成为1份F12和3份DMEM,并加入腺嘌呤(1.8104mol/L),霍乱毒素(1010mol/L),E
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 细胞培养 方法
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【可****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【可****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。