生化实验2电泳.pptx

实验实验思路思路蛋白质的理化性质有哪些？蛋白质的理化性质有哪些？蛋白质的分离方法有哪些？蛋白质的分离方法有哪些？本次实验利用了哪个性质？本次实验利用了哪个性质？生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.掌握电泳法分离蛋白质的原理；掌握电泳法分离蛋白质的原理；2.2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理和方法；和方法；3.3.进一步熟悉进一步熟悉721721型分光光度计的使用型分光光度计的使用 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法分离方法分离方法沉淀法沉淀法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法层析法层析法电学法电学法电泳法电泳法等电聚焦等电聚焦超速离心法超速离心法离子交换层析离子交换层析吸附层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）凝胶过滤（分子筛）亲和层析亲和层析 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷（一）电（一）电 泳泳 技技 术术 (electrophoresis)电泳电泳：带电粒子在电场的作用下向着与其电性带电粒子在电场的作用下向着与其电性 相反的电极移动的现象。相反的电极移动的现象。电泳技术电泳技术:指利用电泳现象对混合物进行分离分指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术析的技术。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷一、电泳的原理一、电泳的原理以蛋白质为例：以蛋白质为例：HOHHOHpHpI pH=pI pH 纤维状分子纤维状分子分子大小：分子大小：生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷Q Q越多，越多，u u越大；越大；分子小，分子小，r r越小，越小，u u越大；越大；2.2.缓冲溶液：缓冲溶液：pHpH值：值：(pH-pI)(pH-pI)越大，越大，Q Q越多，越多，u u越大越大离子强度离子强度(I)(I)：I I越大，电动电势越小，越大，电动电势越小，u u越小；越小；I I越小，电动电势越大，越小，电动电势越大，u u越大，越大，但样品易扩散。但样品易扩散。离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pHpH恒定恒定 选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在围在0.020.020.20.2之间。之间。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。3.3.电场强度电场强度(X)(X)X X越大，越大，u u越快。越快。支持物越短，支持物越短，X X越大，越大，u u越快。越快。电场强度越大或支持物越短，电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。增加，影响分离效果。在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。白质等样品发生热变性而无法分离。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷4.4.支持介质：支持介质：目前常用的电泳支持物：目前常用的电泳支持物：纤维薄膜纤维薄膜(玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜)凝胶凝胶(琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶)生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷负极负极正极正极 表面带负电荷表面带负电荷带正电荷的水层携带粒子向带正电荷的水层携带粒子向负极移动负极移动 如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。移向正极的，则泳动的速度减慢。电渗作用电渗作用：电渗：电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷以纸电泳为例以纸电泳为例:（一）按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为：（一）按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为：1 1滤纸及其它纤维滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤 维薄膜维薄膜)电泳电泳2 2粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；3 3凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；4 4丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。三、区带电泳的分类三、区带电泳的分类 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷（二）按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：（二）按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：1 1平板式电泳：支持物水平放置；平板式电泳：支持物水平放置；2 2垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；3 3垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷(三三)按按pH pH 的连续性不同，区带电泳可分为：的连续性不同，区带电泳可分为：1 1连续连续pH pH 电泳：即整个电泳过程电泳：即整个电泳过程pH pH 保持不变，如常用保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。2 2非连续非连续pH pH 电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH pH 的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等。的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷（二）血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳（二）血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷【实验原理实验原理】1.1.血清中几种主要蛋白组分血清中几种主要蛋白组分血清蛋白质血清蛋白质等电点等电点分子量分子量占总蛋白的占总蛋白的清蛋白清蛋白 4.644.6469,00069,000575772 72 1 1球蛋白球蛋白 5.065.06200,000200,0002 25 52 2球蛋白球蛋白 5.065.06300,000300,0004 49 9球蛋白球蛋白 5.125.1290,00090,000150,000150,0006.56.51212球蛋白球蛋白 6.856.857.3 7.3 156,000156,000950,000950,00012122020v 缓冲液缓冲液pH=8.6pH=8.6v pIpIpHpH血清蛋白血清蛋白带负电荷带负电荷,在电场中向正极移动在电场中向正极移动 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷血清蛋白依次分为清蛋白，血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的球蛋白的1 1、2 2、五个区带五个区带请预测血清蛋白电泳区带图请预测血清蛋白电泳区带图清蛋白清蛋白 1 1 2 2 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷v膜条经过氨基黑膜条经过氨基黑10B10B染色后显出清晰色带。染色后显出清晰色带。2.2.定量定量 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷v各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。v可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。v用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。3.3.血清蛋白电泳结果的临床意义：血清蛋白电泳结果的临床意义：生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷临床上还可用临床上还可用A/GA/G比来表示清球蛋白的量的关系：比来表示清球蛋白的量的关系：正常人正常人A/GA/G1.51.52.52.5可能相关疾病可能相关疾病清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白骨髓瘤骨髓瘤*肾病综合症肾病综合症*肾炎肾炎*肝硬化肝硬化*急性肝坏死急性肝坏死*传染性肝炎传染性肝炎*急性感染初期急性感染初期*慢性炎症慢性炎症/感染后期感染后期*低低 球蛋白血症球蛋白血症*1 1准备与点样准备与点样：取两条取两条2.58cm2.58cm的膜条的膜条充分浸透充分浸透在巴比妥在巴比妥缓冲液中缓冲液中取出膜条取出膜条滤纸吸去滤纸吸去多余的缓多余的缓冲液冲液无光面距一无光面距一端端1.5cm1.5cm处处作点样线作点样线点样器下端点样器下端粘上薄层血粘上薄层血清清垂直垂直点样点样 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷放置放置膜条膜条平衡平衡5分钟分钟通通电电关闭关闭电源电源2 2电泳电泳点样面向下点样面向下点样端置于阴极点样端置于阴极膜条贴膜条贴紧滤纸，紧滤纸，拉直膜条拉直膜条电压：电压：160v时间：时间：60 min 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷通通 电电完完 毕毕浸于染色液浸于染色液（氨基黑（氨基黑10B10B）中）中取出取出膜条膜条浸于漂浸于漂洗液洗液3 3染色、脱色染色、脱色取出取出膜条膜条5min浸于漂浸于漂洗液洗液2min5min浸于漂浸于漂洗液洗液滤纸吸滤纸吸干薄膜干薄膜5min直至直至漂净漂净 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷取试管取试管6支支编号编号16.定量定量(两人的膜条共用两人的膜条共用)试管编号试管编号A1 12 200.4mol/LNaOH 6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml蛋白条带蛋白条带 清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白无蛋白区无蛋白区充分振荡充分振荡脱净染料脱净染料比比 色色定定 量量 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1 1计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。清蛋白（清蛋白（2A/2A/T T）1001001 1球蛋白（球蛋白（1 1/T T）1001002 2球蛋白（球蛋白（2 2/T T）100100球蛋白（球蛋白（/T T）100100球蛋白（球蛋白（/T T）100100光密度总和光密度总和T T2A2A1 12 22 2计算出清蛋白与球蛋白之比值（计算出清蛋白与球蛋白之比值（2A/G2A/G）G=G=1 12 2 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.点样面为不光滑面，勿用手触摸感知；点样面为不光滑面，勿用手触摸感知；2.2.点样量适中，垂直点样；点样量适中，垂直点样；3.3.点样端接电泳仪负极；点样端接电泳仪负极；4.4.膜条与滤纸需贴紧，拉直；膜条与滤纸需贴紧，拉直；5.5.谨防触电。谨防触电。生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷v1 1在本实验电泳过程中，正负电极各发生什么反应在本实验电泳过程中，正负电极各发生什么反应?电极电极附近的缓冲液有什么变化附近的缓冲液有什么变化?v2.2.电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？v3.3.除利用电泳法分离蛋白质以外除利用电泳法分离蛋白质以外,还有哪些分离方法还有哪些分离方法?v4.4.简单绘制血清蛋白电泳后的谱图。简单绘制血清蛋白电泳后的谱图。v5.5.电泳后各区带应明显分开电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐如分离不清或不整齐,试分析试分析其可能存在的原因。其可能存在的原因。思考与练习思考与练习 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷1.蛋白质的理化性质？蛋白质的理化性质？2.蛋白质的盐析？蛋白质的盐析？3.蛋白质的显色反应有哪些？蛋白质的显色反应有哪些？4.分离蛋白质的方法有哪些？分离蛋白质的方法有哪些？5.层析技术的分类及各自的原理。层析技术的分类及各自的原理。6.透析的原理？透析的原理？下次课预习内容下次课预习内容 生物化学教研室生物化学教研室 朱欣婷朱欣婷