细胞悬浮培养课件.pptx
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1、 单细胞的分离单细胞的分离q由完整的植物器官分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞q由培养组织(如愈伤组织)由培养组织(如愈伤组织)中分离单细胞中分离单细胞1 由完整的植物器官分离单细胞机械法机械法酶解法酶解法 叶片是分离单细胞的最好材料叶片是分离单细胞的最好材料1.1 1.1 机械法机械法 方法方法A:用刀片刮叶片:用刀片刮叶片 (花生成熟叶片花生成熟叶片)具体方法具体方法:撕去表皮撕去表皮露出叶肉细胞露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞用解剖刀刮下细胞 方法方法B:叶片研碎、离心:叶片研碎、离心轻轻研磨轻轻研磨加研磨介质加研磨介质过滤、离心过滤、离心 研磨介质:研磨介质:40ml40ml 20umo
2、l Sucrose 20umol Sucrose 10umol MgCl 10umol MgCl2 2 20umol tris 20umol trisHCL HCL(三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷)PH 7.8 PH 7.8 注意注意:只有薄壁组织排列松散,细胞间结触只有薄壁组织排列松散,细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。功。注意注意:大麦、小麦和玉米很难通:大麦、小麦和玉米很难通过酶解法使细胞分离。过酶解法使细胞分离。(叶肉细胞伸长,并在许多地方叶肉细胞伸长,并在许多地方收缩,细胞间形成一种互锁结构收缩,细胞间形成一种互锁结构)事例
3、分离篱天剑叶肉细胞的机械方法叶片消毒匀浆过滤离心植板75酒精,7次氯酸钠10ml培养基1.5克1cm2叶片低速,去碎屑,游离细胞沉降1.2 1.2 酶解法酶解法TakebeTakebe等(等(19681968)最早报道:用果胶酶处理)最早报道:用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶加果胶酶过滤过滤、离心、离心1.3 1.3 机械法和酶解法比较机械法和酶解法比较机械法机械法酶解法酶解法1.细胞不受到酶的伤害;细胞不受到酶的伤害;2.不用质壁分离;不用质壁分离;3.细胞产量低;细胞产量低;4.细胞易破。细胞易破。1.细胞受到酶的伤害;细胞受到酶的伤害;2.要质壁分离;要质
4、壁分离;3.细胞产量高;细胞产量高;4.细胞不易破。细胞不易破。2 2 由培养组织(愈伤组织)分离单细胞由培养组织(愈伤组织)分离单细胞材料:胡萝卜肉质根材料:胡萝卜肉质根步骤:步骤:1 诱导产生愈伤组织2 愈伤组织反复继代,使组织不断增殖,提高愈伤组织的松散性;摇床用于振荡继代悬浮3 Subculture 将愈伤组织在液体培养基中培养,建立悬浮培养物优点:细胞团成小细胞团或单细胞;在培养基中均匀分布;有空气交流。植物细胞悬浮培养 技术(Suspension culture)特点:特点:细胞可以不断增殖,形成高密度的细胞群体,适于大规模培养;能够提供大量较为均匀的细胞,为研究细胞的生长、分化创
5、造方法和条件。必须指出:悬浮培养中既有单细胞,也有小细胞团。概念:是指一种在受到不断摇动的液体培养基里,培养单细胞及小细胞团的组织培养系统。1、起始悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏松,细胞分散程度大;质地紧密,细胞分散程度小,不适于悬浮培养转速30150rpm防细胞破裂2、悬浮培养的基本形式、悬浮培养的基本形式分批培养连续培养2.1 分批培养(Batch culture)2.1.1 含义:将细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外,一切都是密闭的。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。2.1.2 2.1
6、.2 特点特点 培养基体积固定 当培养基中的营养物质耗尽时,细胞的分裂和生长也停止 必须适当搅拌2.1.3 继代的方法和最佳时期继代方法:用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物,并移到含有新鲜培养基的培养瓶里,继续进行培养。注意:要适当稀释继代最佳继代时期:选择指数生长期和直线生长期。2.1.4 细胞生长曲线在整个培养过程中,细胞数目不断发生变化,呈现出明显的由慢到快,再到慢,最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S形曲线滞后期(lag phase)指数生长期(exponential phase)直线生长期(linear phase)减慢期(progressive decel
7、eration phase)静止期(stationary phase)培养时间培养时间培培养养细细胞胞数数目目1234512345滞后期(lag phase)细胞很少分裂,其时间长短取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少培养时间培养时间培培养养细细胞胞数数目目123451指数生长期(exponential phase)细胞分裂活跃,细胞数目迅速增加 培养时间培养时间培培养养细细胞胞数数目目123452直线生长期(linear phase)细胞生长和发育最快的时期培养时间培养时间培培养养细细胞胞数数目目123453减慢期(progressive deceleration ph
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