DNA测序技术的原理、发展及在医学中的应用.ppt
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1、DNA测序技术的测序技术的原理、发展及在医学中的应原理、发展及在医学中的应用用DNA测序技术DNA是一种长链聚合物,组成单位为四种脱氧核苷酸(dATP dTTP dCTP dGTP)。这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列,可组成遗传密码,指导蛋白质的合成。测序分析能够为基因DNA序列提供最真实可靠的信息,它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性。DNA测序技术测定未知序列研究基因组多样性确定重组DNA的方向与结构对突变进行定位和鉴定DNA测序的发展历程经典DNA测序技术70年代末,Maxam和Gilbert发明化学法、Sanger发明双脱氧终止法手动测序(同位素标记)80年代中期,出现自动测
2、序仪(应用Sanger双脱氧终止法原理)、荧光代替同位素,采用计算机图象识别90年代中期,测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳2001年完成人类基因组框架图,全部采用基于Sanger双脱氧原理的自动化毛细管测序。DNA测序的发展历程DNA测序的发展历程第二代测序技术DNA测序的发展历程454 的特点与主要应用读长较长,400600bp通量较低,400600Mb相对成本较高主要应用:de novo测序DNA测序的发展历程Solexa 的特点与主要应用读长较短,100150bp通量高主要应用:RNA测序、表观遗传学研究DNA测序的发展历程SOLiD 的特点与主要应用读长较短,50-75b
3、p精度高,通量高,主要应用:基因组重测序、SNP检测等DNA测序的发展历程三种第二代测序技术对比DNA测序的发展历程第三代测序技术第三代测序技术第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增,而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外,第二代测序的读长普遍偏短,在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点,业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。DNA测序的发展历程第三代测序技术第三代测序技术双脱氧链末端合成终止法1977年,英国人Frederick Sanger 创建了双脱氧链末端合成终止法(chain termination metho
4、d),简称Sanger法、双脱氧法或酶法。他发现如果在DNA复制过程中掺入ddNTP,就会产生一系列末端终止的DNA链,并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。双脱氧链末端合成终止法双脱氧链末端合成终止法双脱氧链末端合成终止法双脱氧链末端合成终止法双脱氧链末端合成终止法基本原理是利用DNA聚合酶,以待测单链DNA为模板,以dNTP为底物,设立四种相互独立的测序反应体系,在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP)作为链延伸终止剂。在测序引物引导下,按照碱基
5、配对原则,每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链,通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,放射自显影检测后,从凝胶底部到顶部按53方向读出新合成链序列,由此推知待测模板链的序列。双脱氧链末端合成终止法测序序时分成四个反分成四个反应,每个反每个反应除上述成分外分除上述成分外分别加入加入2,3-双脱氧的双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸(称核苷三磷酸(称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后然后进行聚合行聚合反反应。在第一个反。在第一个反应中中,ddATP会随机地代替会随机地代替dATP参加反参加反应,一旦,一旦ddATP加入了新合成的加入了新合成的DNA链,由于其第,由于
6、其第3位的位的-OH变成了成了-H,所以不能所以不能继续延伸延伸,于是第一个反于是第一个反应中所中所产生的生的DNA链都是到都是到A就就终止了。止了。具体操作具体操作双脱氧链末端合成终止法双脱氧链末端合成终止法引物在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模板,还是双链DNA模板,都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物。通用引物的长度一般为1530个核苷酸。如果是PCR产物直接测序,也可以用一端的PCR引物双脱氧链末端合成终止法测序酶(sequenase)测序酶是一种经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶,消除了35外切酶活性。该酶活性非常稳定,具有很高的链延伸能力和
7、极快的聚合反应速度,是测定较长DNA的首选酶。双脱氧链末端合成终止法测序产物的凝胶电泳及识读能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列分析成败的关键。最早采用放射性标记引物,后来采用荧光剂标记。DNA序列分析的自动化激光测序法终止标记系统是用4种不同的荧光染料标记不同的ddNTP。测序反应可以在同一反应管内进行,不必分成4管,反应产物按终止位置的碱基不同其3末端带有不同的荧光基团,被激发后产生不同的荧光,将反应产物加样于凝胶的同一加样孔,电泳分离后,经过DNA测序仪分析系统识别,将检测将信号不断传送到计算机,通过软件分析,自动读出待测DNA的全部核苷酸序列。DNA序列分析
8、的自动化DNA序列分析的自动化毛细管电泳 毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)是以高压直流电场为驱动力,在毛细管内使荷电粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化等优点Maxam-Gilbert DNA 化学降解法基本原理:直接或间接特异性识别4 种碱基特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰在修饰碱基处(5或3)打断磷酸二酯键将一个DNA 片段的5 端磷酸基作放射性标记,再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基,从而产生一系列长度不一而5 端被标记的DNA 片段,这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离,
9、再经放射线自显影,确定各片段末端碱基,从而得出目的DNA 的碱基序列。Maxam-Gilbert DNA 化学降解法操作步骤 先用限制性内切酶把DNA切成10200bp 的测序材料;用碱性磷酸化酶处理该片段,消除5末端上的磷酸;在5OH端标记 32P,用多核苷酸磷酸激酶催化;标记片段变性为单链;用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰,然后用哌啶甲酸切断反应碱基的多核苷酸链,紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段,产生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段;经电泳和放射性自显影后,从4个反应系统统一阅读,待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出Maxam-
10、Gilbert DNA 化学降解法Maxam-Gilbert DNA 化学降解法该反应的关键在于使该反应的关键在于使DNA的的4种核苷酸中,只有种核苷酸中,只有1-2种发生特异性的化学切割反应:种发生特异性的化学切割反应:碱基的特异性修饰;修饰的碱基从核糖环上转移;失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰,并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。Maxam-Gilbert DNA 化学降解法 肼,又称联氨 NH2.NH2 在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置导致糖苷键断裂。如果加入
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