DB13_T1721-2013辣椒轻斑驳病毒检验检测技术规程+(1).docx
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1、ICS 65.020B 16DB13河北省地方标准DB13/T 17212013辣椒轻斑驳病毒检验检测技术规程Technical Regulations for Detection of Pepper mild mottle virus2013- 05-27 发布2013-06 -15 实施河北省质量技术监督局发 布DB13/T 17212013前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位:河北农业大学。本标准主要起草人:王亚南、曹克强、王树桐、胡同乐、杨军玉、冀志蕊。IDB13/T 17212013辣椒轻斑驳病毒检验检测技术规程1 范围本标
2、准规定了辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)的检验检测与鉴定方法。本标准适用于可能带有辣椒轻斑驳病毒的甜(辣)椒种子和苗木的检验检测工作。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1辣椒轻斑驳病毒病是由辣椒轻斑驳病毒危害辣椒属植物引起的一种病毒病害,在甜(辣)椒上表现为不同程度的叶片或(和)果实的变色、斑驳、畸形或坏死条斑甚至植株矮化等症状。2.2辣椒轻斑驳病毒是危害辣椒属植物的一种烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病原病毒,学名为Pepper mild mottle virus,简写PMMoV。病毒粒体直杆状,基因组为正单链RNA,由635
3、7个核苷酸组成。3 原 理依据PMMoV具有很强的免疫原性,可采用ELISA或免疫胶体金试纸条方法进行检测;依据PMMoV基因组序列的特异性,可采用RT-PCR方法进行检测。PMMoV病原特性见附录A。4 材料、仪器、用具及药品4.1 材料甜(辣)椒种子、叶片或果实。4.2 仪器、用具超低温冰箱(箱内温度可达-80以下);高速冷冻台式离心机(最高转速在12000 r/min以上); PCR仪(常规配置);凝胶成像系统(常规配置); 电泳仪(常规配置);水平电泳槽(常规配置);酶标仪(常规配置);15 调查与取样5.1 田间调查在甜(辣)椒生长期进行调查,带有附录B记述的PMMoV为害症状的植株
4、为疑似病株。5.2 种子取样在11月翌年2月份对市场销售的甜(辣)椒种子进行扦样(数量以满足检测鉴定所需为限),然后进行检测与鉴定。5.3 田间样品采集与保存选取疑似病株上症状明显的叶片或果实(其数量以满足检测鉴定所需为限),装入聚乙烯塑料袋中密封,放入带有冰块的采集箱中带回实验室。采集袋标签应注明采集时间、地点、采集人等信息。采集的样品应放入超低温冰箱中(-80)保存,要尽早进行检测与鉴定。6 检测与鉴定6.1 免疫胶体金试纸条测定将疑似病株少量发病叶片或果实预先研磨成汁液,利用免疫胶体金试纸条进行检测。具体操作见附录C。6.2 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)将样品粗提液加
5、入已包被PMMoV抗体(市售)的酶联板中,进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。设无病组织阴性对照、染病组织阳性对照和提取缓冲液空白对照,其中阴性对照种类和材料应尽量与检测样品一致。具体操作见附录D。6.3 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分别提取各样品总RNA,反转录合成cDNA,进行PCR扩增。设无病组织阴性对照、染病组织阳性对照和超纯水空白对照。具体操作见附录E。7 结果判定与记录免疫胶体金试纸条适用于田间快速诊断,DAS-ELISA适合于样品批量检测,RT-PCR技术适用于病毒精准鉴定。在需要田间现场快速检测的情况下可选择免疫胶体金试纸条方法,检测为阳性,可判定为检
6、出PMMoV,检测为阴性,初步判断为未检出PMMoV,若需准确鉴定,应采用RT-PCR复检;样品批量检测选2用DAS-ELISA方法,若DAS-ELISA检测为阳性,可判定为检出PMMoV,DAS-ELISA检测为阴性,应采用RT-PCR 方法复检。完整的实验记录包括:样品来源、品种、时间、地点、方法和结果等。PCR检测需要有电泳结果照片;酶联测定需要有酶联板反应的照片和原始数据;免疫胶体金试纸条测定需要有试纸条检测结果照片或妥善保存的试纸条。3DB13/T 17212013附 录 A(资料性附录)辣椒轻斑驳病毒病原特征A.1 分类和命名A.1.1 学名Pepper mild mottle v
7、irus(PMMoV)。A.1.2 分类地位烟草花叶病毒属(Tobamovirus)。A.2 病原特征A.2.1 病毒粒子病毒粒体外无囊膜包被,螺旋对称结构,直杆状,大小为18nm312nm。轴芯直径4nm,螺旋结构明显,螺距2.3nm。A.2.2 核酸单链RNA,分子量2106。基因组RNA由6357个核苷酸组成,共有4个ORF。A.2.3 蛋白分子量17 kD。A.2.4 致病型针对烟草花叶病毒属病毒产生的过敏反应介导的抗性,在辣椒属栽培品种中已经发现有L1、L1a、L2、L3、L4等抗性基因群。烟草花叶病毒属病毒能否克服L 基因介导的抗性能力由其自身的致病型决定,分为P0、P1、P1,2
8、、P1,2,3、P1,2,3,4等5 种致病型。目前,在PMMoV 中已经先后发现P1,2、P1,2,3、P1,2,3,4等3 种致病型,分别能够侵染携带L2、L3、L4抗性基因的辣椒品种。4附 录 B(资料性附录)辣椒轻斑驳病毒的寄主范围、地理分布、生物学特性、为害症状、传播途径及鉴别寄主B.1 寄主范围B.1.1 自然寄主辣椒属植物。B.1.2 寄主范围苋色藜、昆诺藜、曼陀罗、烟草、矮牵牛、罗勒、洋酸浆。B.2 地理分布目前,PMMoV 在世界已广泛分布,阿根廷、澳大利亚、丹麦、法国、匈牙利、冰岛、意大利、日本、荷兰、西班牙、英国、美国及我国的新疆、山东、宁夏、北京、河北等省发生。B.3
9、生物学特性B.3.1 致死温度辣椒轻斑驳病毒的致死温度95。B.3.2 稀释限点辣椒轻斑驳病毒的稀释限点为10-6mL/L10-8mL/L。B.3.3 体外存活期辣椒轻斑驳病毒体外存活期30d以上。B.3.4 等电点辣椒轻斑驳病毒粒子等电点pH为3.383.7。B.4 为害症状在不同品种的甜(辣)椒上症状略有变化,但多数很相似。一般包括叶片不同程度的变色、叶片卷曲。果实的斑驳、扭曲畸形、变小或颜色的改变,有时果实或叶片有明显的褐色坏死条斑。严重的造成植株生长缓慢,矮化等症状。B.5 传播方式5PMMoV有多种传播方式:1.种子传播;2.接触传染(包括植物间接触、农事操作、汁液);3.病残体或带
10、有病残体的土壤;4.其他(啮齿动物的粪便、栽培营养液、河水、灌溉水、被污染的包装容器、用作肥料的牛粪)。其中带毒种子是远距离传播主要途径,接触性传染是近距离传播主要途径。B.6 鉴别寄主B.6.1 白曼陀罗(Datura metel)局部坏死症状。B.6.2 曼陀罗(Datura stramonium)局部枯斑症状,无系统侵染。B.6.3 昆诺藜(Chenopodium quinoa)局部斑驳症状,无系统侵染。B.6.4 心叶烟 (Nicotiana glutinosa)局部枯斑症状,无系统侵染。B.6.5 野生烟 (Nicotiana sylvestris)局部枯斑症状,无系统侵染。B.6.
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