无菌检验课件PPT课件.ppt

医疗器械无菌检验何燕英何燕英广东省医疗器械质量监督检验所广东省医疗器械质量监督检验所20112011年年0707月月1概 述直接进入人体血液循环系统、肌肉、皮下组织或接触创伤、溃疡等部位而发生作用的制品或要求无菌的材料、灭菌器具等都要进行无菌检查。“无菌”是指微生物存活概率低于10-6；“无菌医疗器械”表示为医疗器械中，有残存微生物的医疗器械的概率小于10-6，即一百万件中小于1件。2无菌检验n n用于检验一次性使用无菌医疗器械是否染有活菌的一种方法。n n本实验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，同时也应避免在抑菌条件下进行实验操作。3检测标准n nGB/T 14233.2-2005 GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器医用输液、输血、注射器具检验方法具检验方法 第二部分：生物试验方法第二部分：生物试验方法中中“3.3.无无菌实验菌实验”。n n中华人民共和国药典中华人民共和国药典 2010 2010年版二部附录年版二部附录XI XI HH“无菌检查法无菌检查法”。4实验条件n n无菌操作技术n n实验环境n n实验器材5无菌操作技术n n微生物学基础n n微生物实践基础n n无菌操作意识6实验环境n n洁净度洁净度1000010000级下的局部洁净度级下的局部洁净度100100级的单向级的单向流空气区域或隔离系统流空气区域或隔离系统n n定期按定期按GB/T16292-16294-2010GB/T16292-16294-2010 医药工业医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法试方法的现行国家标准进行洁净度验证的现行国家标准进行洁净度验证n n实验中监控：实验时将制备好的营养琼脂平板实验中监控：实验时将制备好的营养琼脂平板打开放于实验台上，至实验结束收起，打开放于实验台上，至实验结束收起，30 30 3535培养培养48h48h，菌落平均数应小，菌落平均数应小1cfu/1cfu/90mm7实验器具n n仪器仪器 超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪、比浊仪等。汽灭菌器、集菌仪、比浊仪等。n n用具用具 试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密密pHpH试纸、集菌培养器、剪刀、镊子、无菌服、试纸、集菌培养器、剪刀、镊子、无菌服、牛皮纸等。牛皮纸等。8实验准备n n实验环境保证n n实验试液n n培养基n n灭菌方法9实验环境保证n n环境清洁，表面消毒（75%(V/V)乙醇、新洁尔灭(1：1000)溶液或其他适宜消毒溶液）n n空气过滤系统，紫外灯或臭氧空气消毒仪10实验试液n n 稀释剂 1.0.9%氯化钠溶液 2.0.1%蛋白胨水溶液 3.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：调解pH至近中性，其中蛋白胨对菌细胞有保护作用，有利于菌数及控制菌测定n n表面活性剂与中和剂 11培养基n n硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基(用于培养好氧菌、厌氧用于培养好氧菌、厌氧菌菌)，置，置30 3530 35培养培养其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/21/2。在供试品接种前在供试品接种前,培养基氧化层的高度培养基氧化层的高度 不得超过培养基深度的不得超过培养基深度的1/51/5，否则，否则,须经须经 100100水浴加热至粉红色消失（不超过水浴加热至粉红色消失（不超过 2020分钟）迅速冷却分钟）迅速冷却,只限加热一次，并只限加热一次，并 应防止被污染。应防止被污染。12培养基n n改良马丁培养基（用于培养真菌）置2328培养欧、美、日药典：大豆酪蛋白水解液培养基（SCD），适用于需气、厌气真菌及需气菌培养。13培养基n n保存：2 25、避光 n n保存时间 非密闭容器中：一般在三周内使用 密闭容器中：一般可在一年内使用14灭菌方式n n湿热：115 121，15min30min 物品切勿立即取出置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，以致染菌。n n干热：160 170 ，2h 适于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭菌。n n灭菌程序需要经过验证15培养基适用性检查n n培养基的无菌性检查n n培养基灵敏度检查n n本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。16培养基的无菌性检查n n每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养14天，应无菌生长。17培养基灵敏度检查n n菌种金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26 003铜绿假单胞菌 CMCC（B）10 104枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63 501生孢梭菌 CMCC(B)64 941白色念珠菌 CMCC(F)98 001黑曲霉 CMCC(F)98 003 18培养基灵敏度检查n n菌株要求 传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。19培养基灵敏度检查n n菌液制备 细菌新鲜培养物（一般18h24h，白念24h48h，黑曲霉 57天 ），用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100cfu的菌悬液（黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液）20培养基灵敏度检查n n培养基接种培养基接种 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌2 2支支 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌2 2支支硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌2 2支支 生孢梭菌生孢梭菌2 2支支 空白对照空白对照1 1支支每管小于每管小于100cfu100cfu，培养，培养3 3天天 21培养基灵敏度检查n n培养基接种培养基接种 白色念株菌白色念株菌2 2支支 改良马丁培养基改良马丁培养基 黑曲霉黑曲霉2 2支支 空白对照空白对照1 1支支每管小于每管小于100cfu100cfu，培养，培养5 5天。天。22培养基灵敏度检查n n结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管试验菌生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。23方法验证n n无菌实验方法薄膜过滤法优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。直接接种法24方法验证n n薄膜过滤法薄膜过滤法 规定量的供试品规定量的供试品过滤过滤 接种接种 硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 滤膜滤膜 改良马丁培养基改良马丁培养基冲洗冲洗每种菌均作每种菌均作1 1管不含供试品管作为对照管不含供试品管作为对照加入试验菌加入试验菌过滤过滤25方法验证n n直接接种法直接接种法 硫乙醇酸盐流体培养基：硫乙醇酸盐流体培养基：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌2 2管管大肠埃希菌大肠埃希菌2 2管管枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌2 2管管生孢梭菌生孢梭菌2 2管管改良马丁培养基：改良马丁培养基：白色念珠菌白色念珠菌2 2管管黑曲霉黑曲霉2 2管管n n每种菌均作每种菌均作1 1管接入规定量的供试品，另管接入规定量的供试品，另1 1管作为对照品管作为对照品26方法验证n n结果判断结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验条件下无抑菌作均生长良好，则供试品的该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，可照此检查法和用或其抑菌作用可以忽略不计，可照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查检查条件进行供试品的无菌检查如含供试品的任一容器中试验菌生长微弱、缓如含供试品的任一容器中试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，须依实际情况调整实验方法，条件下有抑菌作用，须依实际情况调整实验方法，并重新进行方法验证并重新进行方法验证27供试品无菌检验n n细菌检测管：硫乙醇酸盐流体培养基+供试品n n真菌检测管：改良马丁培养基+供试品n n阳性对照管：对应阳性菌+对应培养基+供试品n n阴性对照管28供试品无菌检验n n检验数量：是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。n n一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加最小检验数量的1/2作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。29供试品无菌检验n n检验量：是指一次试验所用的供试品总量（检验量：是指一次试验所用的供试品总量（g g或或mlml）。）。n n采用直接接种法时，若每支（瓶）供试品的装量采用直接接种法时，若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。n n采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。所有容器内的全部内容物过滤。30313233供试品无菌检验n n供试品处理供试品进入无菌实验室前应作表面消毒，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。34供试品无菌检验n n供试品处理供试液制备 水溶液供试品，取规定量，直接过滤或接种，必水溶液供试品，取规定量，直接过滤或接种，必要时须冲洗或加入中和剂灭活剂要时须冲洗或加入中和剂灭活剂a)a)可溶于水的固体制剂供试品，按比例溶解稀可溶于水的固体制剂供试品，按比例溶解稀释后同水溶液项检测释后同水溶液项检测 b)-b)-内酰胺类抗生素供试品，按水溶液或固体内酰胺类抗生素供试品，按水溶液或固体制剂项检测，以制剂项检测，以-内酰胺酶清除或中和抗生素内酰胺酶清除或中和抗生素 c)c)具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品，以一定量冲洗液冲洗内壁后，按水溶液项试品，以一定量冲洗液冲洗内壁后，按水溶液项检测检测 35供试品无菌检验n n供试品处理供试品处理供试液制备供试液制备 非水溶性制剂供试品，稀释液中加入聚山梨酯非水溶性制剂供试品，稀释液中加入聚山梨酯8080或其他适宜乳化剂，或其他适宜乳化剂，混合后同水溶液项检测混合后同水溶液项检测 可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品，以十四烷酸异丙酯可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品，以十四烷酸异丙酯溶解过滤，仍无法过滤者用溶解过滤，仍无法过滤者用100ml100ml稀释液萃取上述供试液，取水相作稀释液萃取上述供试液，取水相作供试品检测供试品检测 无菌气（喷）雾剂供试品，无菌气（喷）雾剂供试品，-20-20冷冻冷冻1h1h，无菌钻孔，取样，依样品，无菌钻孔，取样，依样品性质选择处理方法检测性质选择处理方法检测 装有药物的注射器供试品，药液与针头均需检测，针头直接接种装有药物的注射器供试品，药液与针头均需检测，针头直接接种 敷料供试品，敷料供试品，100mg100mg或或1cm*3cm1cm*3cm 肠线、缝合线等供试品，直接接种肠线、缝合线等供试品，直接接种 灭菌医用器具供试品灭菌医用器具供试品 ，直接接种，直接接种 放射性药品，直接接种放射性药品，直接接种36供试品无菌检验n n培养及观察培养及观察按规定的温度培养按规定的温度培养1414天天 培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。n n结果结果澄清无菌生长澄清无菌生长浑浊有菌生长浑浊有菌生长转种同种新鲜培养基：观察是否长菌转种同种新鲜培养基：观察是否长菌浑浊，无法判断浑浊，无法判断或取培养液涂片，染色，镜检或取培养液涂片，染色，镜检 37供试品无菌检验n n结果判断 若供试品均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。38供试品无菌检验n n结果判断结果判断符合下列任何一个条件，可判试验结果无效：符合下列任何一个条件，可判试验结果无效：（1 1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；结果不符合无菌检查法的要求；（2 2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。染的因素。（3 3）阴性对照管有菌生长；）阴性对照管有菌生长；（4 4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。不当引起的。39供试品无菌检验n n结果判断试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。40谢谢大家！41