结核与耐药结核快速诊断技术ppt课件.pptx
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1、结核及耐药结核自动化检测技术三月 242 Cepheid我国结核现状结核诊断新技术2015WHO结核诊断指南更新2014年全球结核发病率来源:WHO2015年工作报告2014年中国新发病例:8261552014年中国结核发病率:68/100 000近几年我国结核发病率逐年下降,但仍然属于结核高负担国家2014年全球耐药结核发病率来源:WHO2015年工作报告新发结核病例中的耐药结核比例WHO估算2014年中国耐药结核发病数新发病例:43000复发病例:8200我国属于耐药结核 高负担国家高负担国家的耐药结核发现我国当前耐药结核防控的问题:不充分的耐药病人发现,不充足的耐药病人治疗5.56%纳入
2、治疗结核诊治出现偏差!n过多依赖X-光片或其他影像学检查,忽略了以痰标本为基础的微生物诊断n过多依赖未经验证、或不能作为诊断依据的测试,比如血清学检查n只参考传统的微生物检测结果因为这些检测的不可靠性,WHO 不得不采取非常规手段,特别提出反对这些测试的建议全球结核控制不理想的问题出在哪里?可诊断活动期结核感染无法区分活动期结核与潜伏期结核传统技术现代技术影像学涂片镜检培养皮肤菌素试验IGRA分子诊断结核诊断的常见技术n依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性敏感性为50%结核/非结核分枝杆菌不能区分(NTM可能占到40%)n以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响2个月才获得药敏结果,导致患者
3、脱落2个月后调整治疗方案,导致耐药患者的漏诊和传播n无法更早确诊耐药结核患者当前临床诊治的难点9 Cepheid我国结核诊断现状结核诊断新技术2015WHO结核诊断指南更新结核诊断新技术IGRAT-SpotQuantiFeronNAAT技术等温扩增检测技术线性探针基因芯片熔解曲线巢式PCR血清学检测IGRA原理:机体感染过结核分枝杆菌,T-淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌时,产生和分泌特异性的细胞因子IFN-操作步骤:1.反转10次混匀2.37C条件下孵育16-24小时3.2000-3000g离心15分钟4.用移液管取血浆5.每个孔内放50ul结合液6.加入50ul血浆,室温孵育120分钟7.
4、洗板至少6次8.每个孔内加100ul底物,室温孵育30分钟9.加入50ul反应终止液10.450nm波长下读取吸光度11.使用专用软件计算结果操作步骤:1.密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMCs)2.洗涤PBMCs3.将PBMCs与特异抗原一同加入到预包被抗-干扰素抗体的培养孔4.37C孵育16-20小时5.洗涤培养孔6.加标记二抗7.孵育1小时8.洗涤培养孔9.加显色液10.用蒸馏水终止反应11.用肉眼判断结果QuantiFERON-TBT-SPOT.TB采血量:2岁儿童:2-3ml免疫力低下患者:6-8ml其他患者:4-6ml采血量:0.8-1.2ml两者均有大量手工操作步骤,操作要
5、求高QFT低采血量,更具优势IGRAIGRA适用于高收入、结核低负担国家的潜伏结核筛查在中低收入国家,尤其是结核高负担国家,不推荐使用IGRA将IGRA写入国家诊疗指南的有:美国、加拿大、英国、法国、西班牙、德国、意大利、瑞士、荷兰、丹麦、挪威、芬兰、爱尔兰、葡萄牙、捷克共和国、斯洛伐克、波兰、保加利亚、克罗地亚、澳大利亚、沙特阿拉伯、韩国、日本WHO的推荐欧美发达国家或/和结核低负担国家2011年,IGRA在中低收入国家的政策声明环介导等温扩增设备要求较低操作复杂,人工判读结果环介导等温扩增中国CDC推荐可用于基层实验室无耐药检测WHO推荐对于持续有肺结核症状的成人可替代涂片(条件性推荐)可
6、作为持续有肺结核症状的成人的,可作为涂片的后续检测(条件性推荐)备注适用于可开展传统涂片的实验室不应当替代可检测结核和利福平耐药的快速分子诊断技术,尤其是耐药结核高危人群由于缺乏证据,TB-Lamp对于持续有肺结核症状的HIV患者的诊断价值,是否优于涂片尚不清楚TB-Lamp的推荐只适用于检测持续有肺结核症状的患者的痰液样本TB-Lamp对儿童患者的检测由于缺乏数据,仅是推测恒温扩增试纸条法操作步骤:1.将痰液液化、离心、灭活,制备成核酸扩增模板液2.取0.4ul移入1.5mlPCR管中,放入恒温装置中扩增3.使用水浴锅或金属浴;63扩增1小时;4.将完成扩增的PCR管放入一次性防污染扩增物试
7、纸条检测装置中检测,15分钟目测定性结果无需昂贵的仪器无耐药检测手工操作相对较少WHO未评估或推荐恒温扩增 试纸条法WHO在2015工作报告新技术章节中提到该技术但说明目前该技术没有WHO评估并进行推荐所必须的多中心评估的数据实时荧光RNA恒温扩增检测技术RNA检测技术,高灵敏度,可区分活菌和死菌,适用于疗效监测需配备超声波仪,且仍需要实时荧光PCR仪检测无耐药检测WHO未评估或推荐手工操作步骤相对较少线性探针标本制备PCR反应杂交结果判读结果需要人工判读,或配备专门的设备WHO2008年推荐用于涂阳标本检测MDR,2013年更新推荐检测二线药物全程检测需6-8小时配套设备繁多,需3个房间,需
8、PCR仪、杂交仪等手工操作步骤繁多,复杂的结果判读基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基因突变,快速检测分离株或者痰液样本中结核杆菌的两种一线抗结核药耐药利福平、异烟肼WHO未评估或推荐鉴定与药敏需用两套试剂盒,鉴定药敏各需6小时配套设备:需不同PCR室,需PCR仪、杂交仪、扫描仪等,需配备扫描仪及配套软件判读熔解曲线原理:一定环境下,DNA双链在其长度和序列一定时,Tm值也一定,发生错配时,Tm值下降,下降幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关2-3小时获得结果,目前通过CFDA的有利福平和异烟肼耐药两套试剂盒WHO未评估或推荐配套设备:核酸提取仪、PCR仪等核酸提取扩增检测结果分子
9、信标靶序列杂交体每个探针用不同的荧光染料标记,允许同时检测。PCR的目标是rpoB基因的81bp区域:5个探针结合到野生型,而不是突变体目标SPC半巢式半巢式实时荧光实时荧光PCRPCR(XpertXpert)WHOWHO与FIND支持研发成果痰标本与处理液1:2混合吸取2ml处理样品到反应盒将反应盒放入检测模块(手工操作完成)标本自动清洗过滤超声裂解DNA提纯DNA和PCR反应试剂混合半巢式实时荧光定量核酸扩增检测打印检测报告获得检测结果时间:1小时45分钟系统内自动完成Its a development that the world has been waiting for,for lit
10、erally decades.Its something that has the potential of truly revolutionizing the way we deal with TB today.WHO Endorsement of Xpert MTB/RIFThe Test that is Changing the WorldThe Test that is Changing the WorldDr.Mario Raviglione.Director,Stop TB,WHO 2011年WHO评估完成后正式推荐WHO全力推荐Xpert各类分子诊断技术比对(液体培养(液体培养/
11、DST/DST为金标准)为金标准)线性探针基因芯片恒温扩增(试纸条法)RNA恒温扩增LAMP熔解曲线XpertMTB/RIF是否WHO推荐耐药结核诊断否否否否否结核及耐药结核初始诊断仪器通量12(手工)20或48(自动)6或12(选用杂交仪可同时做12个样品)单个通量取决于扩增仪纯手工操作961-80出报告时间6小时6小时2小时2小时2小时2-3小时2小时试剂储存条件部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻部分试剂需冷冻室温储存部分试剂需冷冻室温储存涂阳培阳样本MTB灵敏度无无84.1%584.6%698.2%780%898%3涂阴培阳样本MTB灵敏度无无59.8%561.9%655.6%7
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