PCR技术的原理与方法.ppt
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1、PCR技术的原理与方法技术的原理与方法 钟召迪PCRPCR定义定义l l 聚 合 酶 链 反 应(Polymerase Chain Reaction)简称,是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。l l 是指在DNA 聚合酶的催化下,以母链DNA 为模板,一特定引物为延伸起点,经过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出于母链模板DNA互补的子链DNA的过程。l l 可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等。PCRPCR反应特点反应特点l l特异性强l l灵敏度高l l简便、快速l l对标本的纯度要求低PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理l lPCR的反应成分l
2、lPCR的反应基本步骤l lPCR的反应体系PCRPCR的反应成分的反应成分l l模板DNA l l引物l l四种脱氧核糖核苷酸l lDNA聚合酶l l反应缓冲液,Mg2PCRPCR的反应基本步骤的反应基本步骤l lPCR的反应基本步骤l l变性:高温使双链DNA解离成单链(94 ,30s)l l退火:低温下,引物与DNA模板互补区结合(55 ,30s)l l延伸:中温延伸,DNA聚合酶催化以引物为起点的DNA链延伸反应(7072 ,3060s)PCRPCR的反应体系的反应体系 10扩增缓冲液 1/10体积 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物(2个)0.2umol/L 模板DNA
3、102 105 Taq DNA聚合酶 1 2.5单位/反应体系 Mg2+1.52.5mmol/L 加双或三蒸水至 25 50ulPCRPCR反应五要素反应五要素l l引物(primer)l l 酶(Taq DNA polymerase)l l dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)l l模板(template)l lMg2+(magnesium)引物引物l l引物是PCR特异性反应的关键l lPCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度l l理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增引物设计的原则引物
4、设计的原则l l引物最好在模板cDNA的保守区内设计l l引物长度一般在1530碱基之间l l引物GC含量在40%60%之间,Tm值最好接近72l l引物3端要避开密码子的第3位l l引物3端不能选择A,最好选择Tl l碱基要随机分布l l引物自身及引物之间不应存在互补序列引物设计的原则引物设计的原则l l引物5 端和中间G值应该相对较高,而3 端G值较低l l引物的5端可以修饰,而3端不可修饰l l扩增产物的单链不能形成二级结构l l引物应具有特异性酶及其浓度酶及其浓度l l目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶:从栖热水生杆菌中提纯天然酶:从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶:大肠菌合
5、成基因工程酶:大肠菌合成l l一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100 ul时)l l浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少dNTP dNTP 的质量与浓度的质量与浓度dNTPdNTP的质量与浓度和的质量与浓度和 PCRPCR扩增效率有密切关系扩增效率有密切关系dNTPdNTP呈颗粒状,呈颗粒状,保存不当易变性失活保存不当易变性失活dNTPdNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH1M NaOH或或1M Tris-HCl1M Tris-HCl的缓冲液将其的缓冲液将其pHpH调节到调节到7.07.07.57.
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