RNA提取及PCR相关技术PPT课件.ppt
《RNA提取及PCR相关技术PPT课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《RNA提取及PCR相关技术PPT课件.ppt(48页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、RNA提取提取逆逆转录实验步步骤结果分析果分析PCRqPCR内容内容1-从从RNA提取到基因定性提取到基因定性/定量流程定量流程收集并保存收集并保存组织、血液、血液、细胞等胞等临床床样本本提取、提取、纯化化RNA逆逆转录生成生成cDNAPCR/qPCR进行行定性定性/定量分析定量分析2-样本保存要求本保存要求最好使用新最好使用新鲜样品品组织:取:取样离体后,离体后,立即立即分成分成1cm3左右的小左右的小块,每每块约30-100mg,放入,放入冻存管或存管或锡箔箔纸包好,包好,立即立即放置液氮罐中速放置液氮罐中速冻1小小时,-80冰箱保存。冰箱保存。注意做好注意做好标记,避免反复,避免反复冻融
2、融第一部分第一部分 RNA提取提取3-RNA提取提取样本保存要求本保存要求细胞胞:不建:不建议保存。保存。培养培养处理后理后立即立即提取提取RNA,或或收集收集后,于后,于Trizol液中液中-80 保存。保存。血液血液:不建:不建议长期保存。期保存。或或立即立即分离白分离白细胞后,于胞后,于Trizol液中液中 -80 保存。保存。4-试剂耗材准耗材准备工作工作目的:去除目的:去除RNase,防止,防止RNA降解降解 各种离心管、各种离心管、Tip头、冷、冷冻保存管等塑料器皿:保存管等塑料器皿:浸泡在浸泡在0.1%的的DEPC水中,水中,过夜夜处理,次日烘干,理,次日烘干,高高压灭菌后再次烘
3、干。菌后再次烘干。锡箔箔纸、玻璃匀、玻璃匀浆管、研管、研钵、手、手术剪刀、剪刀、镊子、移液管子、移液管等玻璃、金属及陶瓷制品:等玻璃、金属及陶瓷制品:用用锡箔箔纸严密包裹后,密包裹后,150高温烘烤高温烘烤4小小时。5-前期准前期准备工作工作 RNase-free水:水:0.1DEPC处理去离子水理去离子水过夜,次日高夜,次日高压灭菌除去菌除去 残留残留DEPC,分装,分装1.5ml Eppendorf管,管,4保存。保存。75乙醇:乙醇:用用RNase-free水配制,分装水配制,分装为50ml,4保存。保存。氯仿、异丙醇、无水乙醇:仿、异丙醇、无水乙醇:新包装开封后,分装新包装开封后,分装
4、50ml,4保存。保存。注意:注意:DEPC有吸入毒性,需穿工作服,戴手套、口罩操作。有吸入毒性,需穿工作服,戴手套、口罩操作。6-样本准本准备 组织 大鼠大鼠大鼠大鼠组织组织样样品量品量品量品量总总RNARNA量(量(量(量(gg)脑脑10 mg10 mg8 8 肺肺肺肺10 mg10 mg1010肾脏肾脏10 mg10 mg1010心心心心脏脏10 mg10 mg2020脾脾脾脾脏脏10 mg10 mg3535肝肝肝肝脏脏10 mg10 mg4040 50100mg 组织对应1ml Trizol 7-样本准本准备 细胞胞 悬浮浮细胞:生胞:生长对数期数期诱导后,后,5000g,5min离心
5、去离心去 除培养基,收集除培养基,收集约5-10106个个细胞。胞。每每5-10106个个细胞胞对应1ml Trizol 贴壁壁细胞:生胞:生长对数期数期诱导后,收集后,收集约5-10106个个细 胞,倒掉培养基,加入胞,倒掉培养基,加入预热PBS洗一次,去洗一次,去 除除PBS。每每10cm2培养面培养面积对应1ml Trizol 8-RNA的提取的提取注意佩戴口罩、勤更注意佩戴口罩、勤更换手套手套 组织(1)液氮)液氮预冷研冷研钵;(2)液氮研磨,至)液氮研磨,至样品呈粉末状(需品呈粉末状(需8-10min););(3)向研)向研钵内加入内加入1ml Trizol继续研磨,至呈不黏稠液研磨
6、,至呈不黏稠液态;(4)将混合液)将混合液转移至玻璃匀移至玻璃匀浆器中,冰上匀器中,冰上匀浆3min;(5)将匀)将匀浆液液转移至移至1.5 ml Eppendorf管,室温孵育管,室温孵育5min;裂解裂解9-10-RNA的提取的提取 细胞胞 悬浮浮细胞:离心收集后,倒除培养液,加入胞:离心收集后,倒除培养液,加入1ml Trizol 反反 复吹打复吹打细胞,至溶液不黏稠。胞,至溶液不黏稠。贴壁壁细胞:倒除培养液,胞:倒除培养液,PBS洗洗涤一次后,直接在培养一次后,直接在培养 瓶或培养板中加入瓶或培养板中加入1ml Trizol 反复吹打反复吹打细胞,胞,直至溶液不黏稠。直至溶液不黏稠。室
7、温孵育混合液室温孵育混合液10min后,后,转移至移至1.5 ml Eppendorf管管裂解裂解11-12-Trizol匀匀浆孵育后孵育后80 保存保存加入加入0.2ml氯仿仿,剧烈烈摇动15s;3min at RT,12,000g x 15min,4 分分层取水相,取水相,0.5mL异丙醇异丙醇,颠倒混匀,倒混匀,10min at RT4,12,000g x 10min(片状沉淀物(片状沉淀物为RNA)沉淀沉淀去上清,去上清,1ml 75乙醇乙醇洗洗涤,7,500g x 5min at 4,重复一次,重复一次 洗洗涤空气干燥,加空气干燥,加50ul RNase-free水,水,55 孵育溶
8、解孵育溶解干燥干燥溶解溶解13-RNA提取提取优化步化步骤(1)对得率得率较低的低的样本,可在异丙醇沉淀一步,本,可在异丙醇沉淀一步,选用用-20 度度过夜孵育,以增加得率。夜孵育,以增加得率。(2)对多糖含量多糖含量较高的高的样本,可在异丙醇沉淀一步,加入本,可在异丙醇沉淀一步,加入 高高盐溶液(溶液(0.8M柠檬酸檬酸钠和和1.2M NaCl),),-20度度过 夜共孵育,以去除多糖物夜共孵育,以去除多糖物质的的污染。染。注意:所有注意:所有试剂均需无均需无酶水配制。水配制。14-RNA鉴定及初定量定及初定量 (1)测量量OD值得率及得率及纯度度检测 得率得率 总RNA浓度(度(ug/ml
9、)OD260稀稀释倍数倍数40ug/ml (通常(通常OD260 数数值介于介于0.15-1.0之之间才可靠)才可靠)纯度度 OD260/280检测RNA纯度度 值在在1.8-2.1之之间,RNA纯度度较好;好;值小于小于1.8,表明蛋白,表明蛋白杂质较多;多;值大于大于2.2,表明,表明RNA已降解;已降解;15-RNA鉴定及初定量定及初定量 (2)琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳RNA完整性完整性鉴定定 13ul RNA溶液上溶液上样,1胶,胶,100V电泳泳10min。完整完整RNA呈呈现明明显两条两条带28S,18S,且且28S带约为18S带亮度的两倍;有亮度的两倍;有时也可也可见5S带16-
10、RNA鉴定及初定量定及初定量Electrophoresis gel of the RNA sample17-小小结RNA的保的保护 1.提取前提取前 1.1 新新鲜样品及液氮速品及液氮速冻 1.2 提取工作区提取工作区RNase的清除的清除 1.3 实验用品用品RNase的清除的清除 2.提取中提取中 2.1 组织破碎破碎过程中的保程中的保护 2.2 细胞裂解胞裂解过程中的保程中的保护 2.3 实验人人员保保护措施措施 2.4 保存保存过程中程中3.在后在后续的逆的逆转录过程中仍需保程中仍需保持无持无酶环境境18-第二部分第二部分 RT-PCR 逆逆转录PCRreverse transcrip
11、tionAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5mRNA(sense)Antisense primers:oligo(dT)orrandom hexamersor GSP1st strand cDNAAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5PCR using GSP+GSP1GSP1GSPGSP1(sense)GSP(antisense)1 st strand cDNA19-RT-PCR 逆逆转录 选择方法方法:两步法两步法(适用于多目的基因)(适用于多目的基因)一步法一步法(适用于(适用于单一目的基因)一目的基因)20-RNA逆逆转录 选择逆逆转录引物引物:随机引物随机引物(
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- RNA 提取 PCR 相关 技术 PPT 课件
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【胜****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【胜****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。