DNA的测序方法、原理及其应用.ppt
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1、DNA的测序方法、原理及其应用一、一、DNA序列测定概述及其发展序列测定概述及其发展 即即核酸核酸DNADNA分子一级结构的测定,是现代分子生物学一项分子一级结构的测定,是现代分子生物学一项重要的技术重要的技术。其基本原理是其基本原理是DNADNA的复制反应体系中需要存在的复制反应体系中需要存在DNADNA聚聚合酶、合酶、DNADNA模板、寡核苷酸引物和模板、寡核苷酸引物和dNTPdNTP,引物和模板退火形,引物和模板退火形成双链后,成双链后,DNADNA聚合酶在引物的引导下在模板链上沿聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3 355的方向移动,的方向移动,dNTPdNTP按照碱基配对原则,逐个连接
2、按照碱基配对原则,逐个连接在引物的在引物的3 3-OH-OH末端。末端。1963年,年,Sanger和和Thompson等人第一次完成胰岛素等人第一次完成胰岛素51个个氨基酸的序列测定,这在当时来说是一件了不起的大事。氨基酸的序列测定,这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期,年代后期,Sanger和和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序等人又建立了核酸序列测定的方法,列测定的方法,Sanger双脱氧末端终止法和双脱氧末端终止法和Maxam-Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读直读”阶段,阶段,使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序
3、列测定容易,这样使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易,这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。列。二、测序的常用方法二、测序的常用方法DNA序列测定常用方法有如下3种:1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火,在DNA聚合酶作用下进行延伸反应,用ddNTP终止,用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA,从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段,产生一簇各种长度的短链,经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法,所不同的是用荧光
4、染料标记,计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应,可以对寡核苷酸测序。1、高负荷,1块胶可测16个样品;2、机读不需放射自显影;3、安全不用同位素;4、简单迅速8-10h。1)双脱氧链终止法测序双脱氧链终止法测序(the chain termination method)基本原理:通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链,由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应,产生只差一个核苷酸的DNA分子,从而来读取待测DNA分子的顺序。用于终止反应的双脱氧核苷酸:将2,3 双脱氧核苷酸(ddNTP)参入到新合成的DNA链中,由于参入的ddNTP缺乏3 羟基,因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸
5、二酯键,DNA合成反应将中止。O碱基碱基CPOH12345O碱基碱基CPHH12345H2O脱脱氧氧核核苷苷酸酸的的连连接接O碱基碱基CPHH12345O碱基碱基CPOHH12345OHX双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸?2)Maxam-Gilbert 化学降解法测序化学降解法测序基本原理:基本原理:用放射性核素标记待测用放射性核素标记待测DNA一侧末端一侧末端 将标记将标记DNA分为分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系个反应体系 用不同的化学试剂处理不同反应体系,随机断裂用不同的化学试剂处理不同反应体系,随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个,产生一组一端为放射线标记片段某种碱基中的任何一个,产
6、生一组一端为放射线标记的末端,另一端为不同大小的的末端,另一端为不同大小的DNA片段的混合物片段的混合物 电泳分离,放射自显影得到互相错落的梯形图谱,即可电泳分离,放射自显影得到互相错落的梯形图谱,即可读出读出DNA序列序列表表-特异断裂特异断裂4种脱氧核苷酸的方法种脱氧核苷酸的方法作用的碱基作用的碱基试剂试剂与反与反应应碱基碱基释释放放DNA断裂断裂强强G/弱弱A稀稀释释250倍硫酸二甲倍硫酸二甲酯酯,在,在50mM卡可酸卡可酸(PH8.0)10MMgCl2、0.1MEDTA20060分分钟钟,DNAG的的N7和和A的的N3甲基化甲基化甲基化甲基化嘌嘌呤不呤不稳稳定,定,在中型在中型PH加加
7、热热被破坏被破坏在在0.1M碱中,碱中,9015分分钟钟,戊糖脱,戊糖脱落,落,DNA链链断裂,断裂,G断裂比断裂比A快快5倍倍A同上同上0.2NHCl、0、60分分钟钟,碱基被破坏,碱基被破坏同上,同上,A断裂比断裂比G快快C+T15-18M联联苯胺、苯胺、2050分分钟钟,嘧啶环嘧啶环被破坏被破坏释释放放0.5M哌啶处哌啶处理,断裂理,断裂DNA键键,C与与T有同有同样样速率速率C2MNaCl,联联氨氨处处理方法同上,理方法同上,100分分钟钟,此,此时时,T的的破坏被抑制,只有破坏被抑制,只有C被破坏被破坏释释放放同上,只在同上,只在C处处断裂断裂DNA链链在在4种反应体系中,化学试剂特
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- DNA 方法 原理 及其 应用
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