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鼠伤寒沙门菌PFGE分型及溯源

用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型技术，研究四川省2007年鼠伤寒沙门菌分子流行病学,查找沙门菌污染源,为预测疫情和制定防治措施提供依据。方法 选择Xba I酶对12株鼠伤寒沙门菌全基因组DNA进行酶切，用PFGE对菌株进行分子分型，Bionumerisc 统计软件聚类分析。结果 12株鼠伤寒沙门菌用XbaI 限制性酶切后，分成5个PFGE图谱类型，其中1个PFGE图谱类型有7株菌株，其指纹图谱的相似性达到100％，该型别占分析菌株的58.33%。其余4个PFGE图谱类型分别有2株菌和1株菌。含7株菌的PFGE图谱型中，源于成都市的菌株4株，攀枝花、自贡、内江市的菌株各1株。结论 PFGE分子分型与流行病学资料紧密结合可增强对鼠伤寒沙门菌食源性疾病的溯源和预警。
沙门菌是重要的食源性病原菌, 鼠伤寒沙门菌(S．typhimurium) 是我国引起食物中毒最常见的沙门菌血清型[1]。为掌握鼠伤寒沙门菌在四川省的分布及流行状况，分析比较从不同患者分离到的同一血清型的沙门菌在分子生物学水平的异同及菌株的同源性研究，为传染源追踪和分子流行病学研究及制定防治措施提供依据，对2007年收集的鼠伤寒沙门菌进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型研究，并结合流行病学调查进行分析，结果报告如下。
1.材料与方法
1.1 菌株来源 12株菌株分别分离自成都市、攀枝花市、自贡市、内江市和达州市各哨点医院的沙门菌感染患者（表1），由四川省CDC进行菌株鉴定及血清学分型。

PFGE用分子质量标准参考菌株为：沙门菌Braenderup血清型全球参考菌株H9812，由PulseNet亚太区网络实验室（香港公共卫生署实验室检测中心）分发，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保存。
1.2 PFGE操作 由中国CDC传染病所国家重点实验室完成，实验过程按中国CDC传染病所沙门菌PFGE标准操作方法进行。取平板上的菌落进行菌体的收集及灌制凝胶块，用蛋白酶K消化和采用XbaI 限制性酶切。脉冲场电泳、染色。
1.3 结果判定 用凝胶成像仪摄取图像，PFGE图谱使用BioNumerices数据库软件处理，用Dice-UPGMA法进行聚类分析，不同菌株的电泳带的相似度用Dice系数表示，（F值×100%）表示，根据聚类结果，按不同菌株的相似性系数进行分型。F值反应不同菌株电泳条带的相似程度，范围在0～1之间, 0表示完全不相关，1表示完全相同，出现不同的条带判定为不同的型。0表示完全不相关,菌株被认为流行病学不相关。当分离菌株为1时，即分离菌株的DNA条带具有100％的相似性时，表明菌株来源完全相同[2，3]。

2结果
12株鼠伤寒沙门菌用XbaI 限制性酶切后，分成了5个PFGE图谱类型，其中1个PFGE图谱类型有7株菌株，其指纹图谱的相似性达到100％，该型别占分析菌株的58.33%。其余4个PFGE图谱类型分别有2株菌和1株菌。PFGE图谱图谱结果见图1。
在含有7株菌的PFGE图谱型中，源于成都市的菌株4株，攀枝花、自贡、内江市的菌株各1株。流行病学调查发现，有2名患者明确主述发病前进食了皮蛋，有3名患者发病前的进食的可疑食物调查不详，见表1。

3 讨论
目前世界各国食源性疾病的发生率仍在人类疾病中占据很大的比例。沙门菌是重要的食源性病源菌之一，在我国鼠伤寒沙门氏菌是沙门菌引起疾病的常见血清型。传统的沙门菌实验室鉴定主要是依据细菌的一些表型特征进行,常用的分型方法有：血清学分型、噬菌体分型和药物敏感性分型等[4]，而这些分型方法只能鉴定到沙门菌的血清型。传统的食源性疾病的流行病学调查基本上是依赖详细评价阳性案例和一批适当的对照，确定调查与特殊疾病的关联因素等来进行[5]，而针对同一血清型的不同来源的菌株要比较在分子生物学水平的异同，了解其分布以及在流行状况的调查，进行传染源追踪时，传统的实验室分离鉴定方法已经不能满足要求。
PFGE方法对细菌分型鉴定则是通过限制性内切酶消化菌株DNA ，经PFGE分离，比较酶图谱来确定菌株的亲缘关系。PFGE分型技术因为具有对细菌整个染色体进行分析、分辨率高、重复性好、结果稳定、易于标准化及操作简单的特点，已成为分子流行病学研究技术上细菌分子分型的“金标准” [2.6]，它突破了仅仅是依靠菌株的表型结构的分型和研究，特别是，PFGE的方法由于可以反映碱基的点突变、插入及缺失等多种变异带来的酶切位点的变化，因此更适合用于沙门菌同一血清型内进一步的菌株分型及溯源[7]，并为流行病学的传染源追踪、菌株的同源性研究提供了一种很好的研究手段。
在食源性疾病暴发或流行时，由于PFGE 方法可以揭示从可疑的原因食品、环境因素、从不同患者的呕吐物、排泄物中分离的菌株之间的亲缘关系,因此它能判定引起中毒的原因食品并追溯来源[8]。随着社会经济发展，食品日益趋向集中加工，食品资源在全球范围内流通，食物中毒的暴发形式也发生了变化，常常由单一的暴发形式变得多样化。食物中毒暴发不再像过去那样，简单地集中在某一个地区或者是某个就餐场所，而是有可能在多地同源暴发，或者表现为各地表面上的“散发”。面对这些多种暴发形式，传统分型鉴定水平显然已不能满足在复杂的食源性疾病诊断中对病原体进行溯源的需求，必须有灵敏、准确的检测手段，从分子水平和遗传物质的水平上对不同来源的病原体进行鉴定，才能分析散发与散发、散发于暴发、以及不同暴发之间的关系，确定流行范围，查找传染源，从根本上控制食源性疾病暴发的必需条件，而PFGE方法因其高分辨率和稳定的结果较好的满足了要求，并已被国际上广泛采用[7]。目前在我国已经建立并正在完善基于PFGE 技术的细菌分子分型国家电子网络PulseNet，以便进行食物中毒的快速反应和预警，确定致病菌的亲缘关系,追踪食品的供应渠道和源头。
分析2007年四川省的鼠伤寒沙门菌PFGE结果，从PFGE菌株分型来看：12株菌分成了5个PFGE型别。其中一个PFGE图谱类型有7株菌株，占分析菌株的58.33%，其指纹图谱的相似性达到100％，提示该组菌株高度同源。在这个PFGE图谱型中，源于成都市的菌株4株，攀枝花、自贡、内江市的菌株各1株。PFGE结果提示：这7株菌具有高度的同源性，而发生于成都、攀枝花、自贡和内江市的几起食源性疾病则高度疑似是由这同一克隆株引起的一起鼠伤寒沙门菌引起食物中毒暴发事件。流行病学调查发现，7名患者中，有2名患者明确主述发病前进食了皮蛋，有3名患者发病前的进食的可疑食物调查不详。2名进食皮蛋的患者，1名患者（0780）是成都市三圣乡的农民，另1名患者（0720）是内江市中区公职人员，发病后来成都就医。这 2名患者来自2个不相识的家庭，有着不同的职业，但是从他们身上分离出来的2株鼠伤寒沙门菌的指纹图谱的相似性达到100％，即：PFGE分型为完全相同的克隆株。在完全没有相同之处的不同地域的2名患者之间，他们有一个共同的特点就是：均进食了在集市购买的无品牌散装皮蛋。PFGE和流行病学的调查也提示：高度怀疑正是这株克隆株经某种途径的传播，引起了2007年四川省内鼠伤寒沙门菌的点状暴发。而它的暴发的形式明显的随着食品加工业和物流业的发展，已逐渐表现为在成都市、攀枝花市、内江、自贡市各地表面上的“散发，不用PFGE技术溯源难以将这些发生在不同城市“散发”与暴发流行联系起来。调查结果提示应加强皮蛋加工业的管理和居民的卫生意识教育，以防治中毒的发生。
在0712号和0713号菌株构成的一个PFGE型别，其指纹图谱的聚类相似性也达到96%，认为是一个克隆系。在这个型别中，这2株菌分别来自成都市和达州市，其中一名患者，发病前进食皮蛋。
0726号和0711号分别为2个独立的PFGE基因型别。其中，0726号菌株分离自攀枝花市确诊的一起由皮蛋引起的食物中毒患者的粪便，从PFEG图谱来看，这是一起独立的食源性疾病暴发事件。
从同一地区来源的菌株分型来看：成都市的6株菌，分属于4个型别；攀枝花的2株菌，分属于2个型别；自贡市的2株菌，也分属于2个型别。
用PFGE分型技术，清晰的将2007年四川省同一城市的相同血清型的沙门菌分成了不同的型别，同时PFGE分型技术又揭示了不同地区的相同血清型沙门菌之间的情缘关系，为四川省鼠伤寒沙门菌的流行病学调查提供了科学依据。
2007年四川省分离的鼠伤寒沙门菌PFGE分型结果和流行病学调查结果提示：皮蛋与该年鼠伤寒沙门菌引起的食物中毒密切相关。其中，0726号菌株则来源于一个已确诊为鼠伤寒沙门菌食物中毒事件。四川省居民有生食皮蛋的习惯，长期以来不断有皮蛋引起的食物中毒的发生和报道。曾经有对皮蛋能够引起的食物中毒的一些相关环节做过一些研究和调查[9]，但尚不明确自然界中沙门菌污染皮蛋的机制和途径。相信分子生物学技术的兴起可以从分子水平研究和查找中毒的原因[10]，研究引起流行的因素，了解皮蛋与致病性微生物之间的关系，查找传染源，追踪食品的供应渠道，及时采取公共卫生干预行动，进行食物中毒的快速反应和预警，以此达到预防和控制疾病的目的。
致谢：本研究PFGE试验由中国CDC传染病完成，在此对各位老师表示衷心的感谢！