土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定.doc

土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定
一、培养基
1 放线菌培养基
高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。
黄豆粉固体培养基：大豆粉 20g（沸水煮 30min，过滤保留滤液），蔗糖 10g，可溶性淀粉 5g，蛋白胨 2g，酵母膏 2g，NaCl 2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，琼脂 15g，H2O 1000mL，初始 pH7.0。
放线菌发酵培养基：大豆粉 20g（沸水煮 30min，纱布过滤后保留滤液），蔗糖 10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，H2O 1000mL，初始 pH7.0。
2 放线菌形态及培养特征研究用培养基
察氏培养基（ISP1）：蔗糖 30g，NaNO32.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。
麦芽膏－酵母膏培养基(ISP2)：酵母膏 4.0g，葡萄糖 4.0g，麦芽膏 10.0g，微量盐溶液 1mL，H2O 1000mL，琼脂 20g，pH 7.0～7.4。
燕麦片培养基（ISP3）：燕麦片 20g（加 1000mL 水煮 20 分钟，然后用离心或过滤得澄清滤液并补足 1000mL），微量盐溶液 1mL，pH 7.2（微量盐溶液：FeSO4.7H2O 0.1g，MnCl2.4H2O 0.1g，ZnSO4.7H2O 0.1g，H2O 100mL）。
甘油-天门冬酰胺培养基（ISP5）：L-天门冬酰胺 1.0g，甘油 10.0g，K2HPO41g，微量盐溶液 1mL，琼脂 20g，pH 7.0～7.4。
无机盐淀粉培养基：可溶性淀粉 10g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，CaCO32.0g，(NH4)2SO42.0g，微量盐溶液 1mL，H2O 1000mL，pH 7.4。
马铃薯培养基：去皮马铃薯块 200g（1000 毫升水，80℃煮１小时，然后离心或过滤得上清液），葡萄糖20g，pH 7.4。
营养琼脂培养基：蛋白胨 10g，牛肉膏 5.0g，H2O 1000mL，pH 7.4（亦可补加葡萄糖 10g）。
葡萄糖-天门冬酰胺培养基：葡萄糖 10g，L-天门冬酰胺 0.5g，K2HPO40.5g，牛肉膏 2g，H2O 1000mL，pH 7.2。
3 测定生理生化特性供试培养基
淀粉水解测定培养基：可溶性淀粉 10g，K2HPO45.65g，NaCl 0.5g，KNO31g，MgCO31g，琼脂 15g，H2O 1000mL，pH 7.2~7.4。
纤维素水解培养基：MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31g，H2O1000mL。滤纸条（5cm×0.8cm）灭菌 20 分钟。（pH7.0～7.2）
明胶液化培养基：蛋白胨 5g，葡萄糖 20g，明胶 200g，H2O 1000mL，明胶灭菌10min， pH7.0（灭菌 3 次，每次20min，灭菌后立即浸入冷水中冷却。）
牛奶凝固与胨化培养基：脱脂牛奶 1000mL，CaCO30.02g，pH 7.2~7.4，间歇灭菌三次（脱脂牛奶的制备：取新鲜牛奶，煮沸后冷却，经两次离心（3000r/min，10min）脱脂，除去上层油脂，即得脱脂牛奶）。
石蕊溶液配制：称取 2.5g 石蕊浸泡在 100ml 蒸馏水中过夜，使石蕊充分溶解，然后过滤备用。石蕊牛奶的制备：2.5％的石蕊液与脱脂牛奶以 4：100（V/V）比例混合，牛奶呈紫丁香色，分装于试管中，灭菌备用。接种前抽检灭菌是否彻底。
硫化氢产生测试培养基（柴斯钠培养基）：蛋白胨 10g，柠檬酸铁 0.5g，K2HPO41g，琼脂15g ，H2O 1000mL，pH 7.2。
黑色素产生培养基：酪氨酸（L-Tyr）1g，酵母膏 1g，NaCl 8.5g，琼脂 20g，H2O1000mL，pH 7.2。
硝酸盐还原试验培养基：MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31g，NaCl 0.5g，H2O 1000mL，A 溶液：对氨基苯磺酸 0.5g，醋酸（80％醋酸，加 2 倍水稀释）150mL；B 溶液：二苯胺 0.1g，H2O 20mL)
二苯胺试剂（二苯胺 0.5 g 溶于 100 mL 浓硫酸中，用 20 mL 蒸馏水稀释）
碳源利用培养基：（NH4）2SO4 2.64g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4 0.5g， MgS04.7H2O 0.5g，CuSO4.5H2O 0.0064g， FeSO4.7H2O 0.0011g，MnC12.4H2O 0.0079g，ZnsO4.7H2O 0.00l5g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL。
二、实验操作步骤
1 拮抗菌的形态鉴定
1）菌株形态学特征观察
采用插片法，将菌株接种到高氏一号培养基（固体培养基）中盖玻片与培养基的内侧交界线上，置于28℃培养7、14、28 d。用无菌镊子小心取出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在洁净载玻片上直接镜检。
2）菌株的培养特征观察
将菌株接种到察氏琼脂、葡萄糖-天门冬素琼脂、酵母膏-麦牙浸膏琼脂(ISP2)、燕麦片琼脂（ISP3）、无机盐淀粉琼脂(ISP4)、甘油-天门冬素琼脂（ISP5）、马玲薯琼脂，置于 28℃培养，分别在7、14、28 d 后观察其孢子链、气生菌丝体颜色（即孢子链未形成前的颜色）、基质菌丝体的颜色和是否产生可溶性色素。取成熟期的颜色特征为其培养特征，作为定种的依据。
2 菌株的生理生化特性的测定
1）明胶液化试验
在明胶培养基表面(斜面)接种鉴定菌，28℃下培养30d，在第5、10、20、30d各观察一次。观察前放入冰箱冷却20分钟。以液化时间的早晚及程度为依据，确定液化的快慢和强弱。每个菌株3次重复。
2）淀粉酶的测定
将菌种接种于淀粉培养基平板上，采用点接法，培养10天或20天后往培养基表面倒入碘液，如有淀粉酶产生，即将淀粉变成糊精或利用吸收，遇到碘液不变成蓝色，却形成透明圈;圈的大小表示淀粉酶产生的强弱。如不产生淀粉酶，则菌落周围部位遇碘时呈蓝色。
3）硝酸盐还原
将待测菌接种于硝酸盐液体培养基中，置28℃培养箱中培养7d，14d。以不接种作空白培养液对照。在干净的空试管或白色盘中倒入少许培养液，再各加1滴A液和B液，在对照管中同样加入A、B液各1滴。当培养液中滴入A，B液后，若溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等，表示有亚硝酸盐存在，硝酸盐反应阳性。如无红色出现，则可加入1-2滴二苯胺试剂，此时如果成蓝色，则表示培养液中仍有硝酸盐存在而无亚硝酸盐反应，则还原作用为阴性。若不成蓝色，表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都己还原成其它物质，仍按阳性对待。该反应是在较为厌氧的条件下进行的，所以分装培养液时液面易高些。由于亚硝酸盐可以是硝酸盐还原最终产物，也可以是整个还原过程的中间产物，而且各种菌还原速度相差较大，所以培养18~24h的第一次观察应及时。
4）牛奶石蕊试验
在脱脂的牛乳中加l%的石蕊指示剂，分装试管，在115℃条件下灭菌IOmin。接种放线菌后培养，定期观察6周。
5）H2S的产生
将菌株接种到含柠檬酸铁的有机斜面上，置28℃培养10d左右(视菌苔生长成熟为宜)观察结果。若培养基中出现黑褐色沉淀，表示试验为阳性。反之，不变色者为阴性。
6）纤维素水解试验
配制适合放线菌生长而不含碳源的合成基础培养液，分装试管后，以滤纸作纤维素(碳源)，把其切成宽1cm、长6cm的滤纸条，加入试管中，一半浸在液内，一半露在液外，将菌株接种在液外一段滤纸条上，置28℃培养30d后观察。若该菌能将滤纸条分解成一团松散的纤维，或使之折断者为阳性，说明该菌株产生纤维素酶。反之，滤纸无变化者为阴性。
7）产黑色素实验
将菌株接种到黑色素形成培养基，28℃培养 4～5 d，若出现黑色表明具有酪氨酸酶活性，反之则没有。
8）碳源利用实验
碳源利用基础培养基经高压灭菌后，无菌操作加入各种无菌碳源。本实验采用的碳源为：D-果糖，D-木糖，D-半乳糖，D-甘露醇，L-阿拉伯糖，肌醇，L-鼠李糖，D-葡萄糖，蔗糖，棉子糖。各种碳源的灭菌采用乙醚法——称取一定量的碳源干品，装在已灭菌的烧瓶内，然后加足量乙醚，置与通风开启的超净工作台内，直到乙醚挥发干，之后再加无菌水配成 10%的溶液。使用时按比例加到灭过菌的基础培养基中使其最终浓度为 1%。此外还需要一个未加含碳化合物的碳源利用基础培养基作为空白对照。
4 16SrDNA序列分析
1）供试菌株的活化
将试菌株分别配成菌悬液涂布于高氏一号平板上，28℃培养7d左右，菌丝生长茂盛时即可用于提取DNA。
2）菌株DNA的提取
①将供试菌菌丝小心刮下来置于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，将粉末装入1.5rnL灭菌离心管中，并加入600ulDNA提取液。
②摇匀，65℃水浴1h。
③从水洛锅中取出离心管，于12200rpm离心10min，取上清液于另一离心管中。
④加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)抽提细胞蛋白，并充分摇匀(10min)后，于12200rpm离心5min，吸取上清液于一新的离心管中，重复此步骤1一2次。
⑤把上层水相转入1.5mL离心管管中，加入0.6倍体积的冰异戊醇轻轻混匀，沉淀DNA，
置于一20℃冷冻过夜。
⑥12200rpm下离心15min，小心弃掉上清液。用70%乙醇，100%乙醇各清洗一次，除去残余的杂质。
⑦在超净工作台下吹干DNA沉淀。加入10µlTE缓冲液，于-20℃保存待用。
DNA的检测。
3）采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA
(l)稀释缓冲液的制备:取5倍TBE缓冲液l00mL，配制成1xTBE稀释缓冲液，待用。
(2)胶液的制备：:称取0.32g琼脂糖，置于 100mL三角瓶中，加入30mL 1xTBE稀释缓冲液，加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀。加热过程中不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时盖上封口膜，以减少水分蒸发。
(3)胶板的制备:将电泳胶槽平放，插上梳子，梳齿下缘与胶槽底面保持1~左右的空隙。在冷却至50~60℃的琼脂糖胶液中加入 Goldview染色剂，充分混匀至不烫手后将琼脂糖倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。半小时后拔出梳子。将胶槽放入电泳槽内，然后向槽内加入l x TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。注意排除气泡。
(4)加样:取3µL Marker，5ul DNA与3µL 溴酚蓝溶液混匀，用移液枪小心加入样品槽内。
(5)电泳:加完样品后，合上电泳槽盖，立即接通电源。前3min用150v电压，3min后控制电压保持在80v左右。当澳酚蓝移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
(6)检测:将凝胶放入紫外检测仪中，260nm紫外光下检测。
4）16SrDNA序列的PCR扩增
拮抗菌株的基因组DNA提取后通过进行 16SrDNA序列PCR扩增，增大特异片段的含
量并满足测序需要。
(1)引物
采用由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的放线菌通用引物
上游引物：F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3′
下游引物：R: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′
(2)PCR体系环境
本试验中PCR体系为50µL，其中 PCRTaq酶(5U/µL)，10xBuffer(Mg2+ free)，d NTP Mixture(各2.5mM)，Mg2+(2.5mmol/L)，合成引物pl，p2(10µ mol/L)。
扩增体系：
10×Buffer(Mg2+) 5μL
dNTP(10mmol/L) 1μL
引物1: 2.5μL
引物2: 2.5μL
Taq 酶（5U/μL） 0.8μL
Mg2+ 4μL
双蒸水 32.2μL
DNA 模板 2μL
总体积 50μL
(3)PCR程序参数设定
94℃变性5min；94℃变性 40s；55℃复性40s ；72℃延伸1.5min；35 个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
(4)扩增产物的电泳检测
PCR结束后，以l x TBE为电极缓冲液，将扩增产物在 Gold view(0.5µg/mL)的1%琼脂
糖凝胶上电泳分离，选用DNA/EcoRI+Hindln作为Marker，电压80v，电泳1.5-2h后在透过式紫外灯下观察并照相记录。
检测后的PCR产物经海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序。