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口腔鳞癌组织中组织因子的表达
【摘要】  　　目的： 研究口腔鳞癌（OSCC）和口腔正常黏膜中组织因子（TF）的表达及其与微血管密度（MVD）和淋巴结转移的关系，了解OSCC中TF在肿瘤血管生成中的作用，为OSCC的研究和治疗提供理论依据。方法： 应用免疫组织化学SABC方法，检测了42例OSCC和10例正常口腔黏膜中TF的表达和CD34抗体标记的MVD值。结果： 在OSCC组织中TF的阳性表达为64.29 ％，显著高于在正常口腔黏膜组织中的表达（10.00 ％，P<0.01）；TF与肿瘤的淋巴结转移密切相关（P<0.01）；TF的表达与MVD值之间存在显著相关性（r=0.611, P<0.001）。结论： TF参与了OSCC中的血管生成，对OSCC的生长、浸润和转移有促进作用。
【关键词】  口腔肿瘤 癌 鳞状细胞 组织因子 毛细血管 免疫组织化学
　　［Abstract］ Objective: To compare the expression of tissue factor (TF) in normal tissue and in oral squamouscell carcinoma（OSCC），and to investigate the correlation between TF expression and microvessel density （MVD）in OSCC, so as to study the function of TF in angiogenesis，and provide valuable scientific basis for the research and treatment of OSCC. Methods： The expression of TF in 42 cases of human OSCC and 10 specimens of normal oral mucosa was detected by using SABC immunohistochemistry method. Tumor microvessel density （MVD）was evaluated by using IHC with antiCD34 antibody as endothdlial marker. Results： （1）The positive expression rates of TF in tissue was significantly higher in OSCC (64.29%) than that in normal oral mucosa（10.00％；P<0.01）；（2）TF expression was correlated with the lymph node metastasis in OSCC,（P<0.01）.（3） TF expression was  positively correlated with MVD in OSCC.（r=0.611, P<0.001）.Conclusion： TF takes part in the angiogenesis of OSCC and may act in growth，invasion and metastasis of OSCC. It needs further research whether TF could be used as an indictor for the biological characteristics of OSCC.
　　［Key words］ mouth neoplasms; carcinoma, squamous cell；tissue factor；capillaries；immunohistochemistry
　　肿瘤血管生成是指肿瘤细胞诱导的微血管生长以及肿瘤中血液循环建立的过程，它对于肿瘤的生长十分重要,是肿瘤代谢的关键途径。研究发现血管生成参与了包括口腔鳞癌（OSCC）在内的恶性肿瘤的侵袭、转移和复发过程[1～3]。组织因子（TF）即凝血III因子,是生理凝血过程中的重要启动因子。近年发现，恶性细胞、肿瘤浸润的巨噬细胞或内皮细胞上均有TF的高表达，它通过调节“血管生成开关”系统，在肿瘤血管生成过程中发挥重要作用。TF的表达调控及活性调节研究已成为目前阐明肿瘤血管生成机制的新热点。目前TF在OSCC组织中的研究国内外少见报道，本实验通过免疫组织化学的方法从蛋白水平对OSCC中TF的表达进行研究，并探索其与微血管密度（MVD）、淋巴结转移的关系，以了解其在口腔肿瘤血管生成中的功能。
　　1  材料和方法
　　1.1  临床资料
　　收集2005-2006年口腔颌面外科手术切除或活检的标本67例, 分OSCC原发灶组、转移淋巴结组和正常口腔黏膜组。OSCC组42例，男23例，女19例，年龄43～76岁,平均56.92岁；其中舌癌11例，牙龈癌7例，口底癌14例，颊癌5例，腭癌5例；有区域淋巴结转移15例，无淋巴结转移27例；按TNM临床分期，Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅲ～Ⅳ期29例。正常口腔黏膜组10例，男5例，女5例，取自无烟酒嗜好的外伤或正畸拔牙病人。肿瘤标本术前未经任何针对肿瘤的治疗，所有标本均经病理证实。
　　1.2  方法
　　兔抗人TF多克隆抗体（工作浓度1∶50），兔抗人CD34多克隆抗体（工作浓度1∶50），免疫组织化学单染SABC试剂盒及DAB显色剂均购自武汉博士德生物工程公司。所有的组织标本经石蜡包埋切片，连续切5张，厚约4μm。采用免疫组织化学SABC法，染色程序按试剂盒说明书进行。微波抗原修复: 将切片置于0.01mol/L（pH6.0）枸橼酸盐缓冲液500 ml中微波加热至沸腾后（高火）保持3 min，然后低火保持10 min,取出自然冷却至室温。用PBS代替一抗作阴性对照。
　　1.3  免疫组织化学结果判断
　　以细胞质内出现棕黄色颗粒判断为TF阳性细胞。在400倍高倍镜下随机选择3个上皮或癌变视野下按照阳性细胞百贵阳医学院学报  33卷    4期魏宏琳等  口腔鳞癌组织中组织因子的表达分比记分：阳性细胞数＜30 %为阴性表达，＞30%为阳性表达。MVD的评定通过光镜下计数CD34染色阳性的血管内皮，先在低倍镜下寻找血管高密度区（“热点”区域），再在400倍镜下计数微血管数目；分别计数3个视野, 取平均数表示MVD值。在“热点”地区进行血管计数是因为该区更能反映肿瘤的恶性潜能[4]，每1个染成棕黄色又可与周围血管、肿瘤细胞和其它结缔组织分开的内皮细胞或内皮细胞簇被判定为1个微血管[4]。
　　1.4  统计学处理
　　各组数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件包进行，根据数据类型分别采用t检验、行X列表χ2和方差分析,P＜0.05有统计学意义。
　　2  结果
　　2.1  TF的染色结果及表达
　　正常口腔黏膜组织中可见少量着色，多位于基底层（图1）。癌组织中TF阳性细胞分布呈异质性，且染色程度存在差异，阳性细胞胞浆或胞膜呈棕黄色，阳性颗粒粗细不等（图2），尤其见于癌巢边缘。此外，在转移淋巴结中TF阳性细胞为转移癌细胞（图3）。OSCC、转移淋巴结及正常口腔黏膜组织中TF的表达见表1。表1  TF在口腔鳞癌、转移淋巴结和正常组织中的表达（略）注：正常组与淋巴结转移组比较P＜0.01（χ2=7.819）,正常组与鳞癌组比较P＜0.01(χ2=9.578)，淋巴结转移组与鳞癌组比较P＞0.05（χ2=0.028）。
2.2  CD34的表达
　　CD34免疫染色定位于血管内皮细胞膜上。正常口腔黏膜组织中微血管分布较少且均匀;OSCC中微血管形态不规则，分布不均，癌灶边缘血管最密集，呈簇状（图4）。
　　2.3  OSCC组织中TF表达与MVD、临床病理特征的关系 
　　TF的表达和MVD在OSCC不同临床分期、颈淋巴结转移组间差异有统计学意义，见表2。表2  口腔鳞状细胞癌组织中TF表达与MVD、临床病理特征的关系（略）
　　3  讨论

　　研究表明，恶性肿瘤的无限制侵袭性生长及其转移与微血管生成密切相关。微血管的形成为肿瘤的生长和增殖提供氧气和营养物质，并为肿瘤的进一步转移提供通道。前期研究表明，在口腔癌中有大量的血管生成，并和肿瘤的生长、淋巴结的转移密切相关[1]，但口腔癌中血管生成的机理尚不十分清楚。

　　本研究结果表明，TF在正常口腔黏膜组织中表达弱，而在OSCC组织中的表达显著上调(P<0.01)，阳性表达率为64.29%（27/42），这与TF在其他多数肿瘤内表达情况相一致。TF在口腔癌组织中过表达提示它可能与肿瘤发生、发展及转移过程中的某些生物学行为有关。TF 是机体内活性最强的促凝物质之一,在生理性止血过程及多种血栓栓塞性疾病中发挥重要作用,近年来对TF在凝血功能中的作用及与肿瘤生长、侵袭、转移的关系是研究的焦点[4]。本实验用免疫组织化学的方法观察TF在OSCC中的表达，发现TF主要定位在癌巢边缘癌细胞的胞浆，血管内皮细胞和巨噬细胞也可见阳性表达，说明OSCC中TF可能主要由肿瘤细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞分泌产生。

　　本研究还表明，TF高表达与微血管密度、口腔OSCC临床分期、颈淋巴结转移密切相关。在OSCC转移淋巴结中TF高表达，说明在口腔癌中TF促进了肿瘤的血管生成，参与了肿瘤的生长和转移。TF作用于血管生成、促进肿瘤生长的机制可能是促进血凝块形成从而为肿瘤细胞提供生长媒介[5]，并上调血管内皮生长因子（VEGF）的基因表达。VEGF是迄今为止发现的促血管内皮细胞生长和迁移的最强刺激因子[6]，它直接作用于内皮细胞促进血管生成。肿瘤细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞均可释放VEGF（VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD），VEGF与其受体（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3）结合后，可以激活丝裂素活化蛋白激酶（MAPK），使其发生磷酸化，引起细胞内信号的转导，促进内皮细胞的增殖和迁移[7]。当TF与FVIIa结合后，TF细胞内区酪氨酸激酶被激活，引起第二信使Ca2+内流，通过MAPK或PKC途径信号转导引起VEGF转录的增加，TF胞内区的基因突变后上述作用消失，但胞外区的基因突变后对上述作用无影响[8～10]。陈宏等[11]在对急性白血病患者的研究中发现TF可在肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞表达，促进肿瘤生长、浸润与转移，原因之一是TF能诱导肿瘤细胞表达VEGF，调节肿瘤细胞的血管生成－抗血管生成平衡，调节细胞分化。但在口腔癌中TF的具体作用机制还需进一步的研究。

　　本研究显示，在OSCC中TF与MVD密切相关，并和肿瘤的临床分期、淋巴结转移有关，说明TF可能在OSCC中通过促进血管生成而在肿瘤生长、浸润和转移中起到了一定作用，但TF是否能成为口腔癌抗血管生成治疗中的靶向因子仍需进一步研究。
【参考文献】
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