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显微镜技术

第一节 光学显微镜技术概述

第二节 常规光学显微镜技术
一、普通光学显微镜
（一）显微镜的几何光学成像原理
（二）物镜
（三）显微镜的照明聚光镜
（四）视场光阑与孔径光阑
（五）目镜
（六）普通光学显微镜的操作要点：
二、荧光显微镜
（一）荧光的基础知识
（二）荧光显微镜
（三）荧光显微镜的基本操作步骤
（四）荧光显微镜的操作注意事项
（五）荧光显微镜标本制作特点和观察要求
三、倒置显微镜
（一）用途：
（二）V型与U型倒置显微镜
（三）倒置显微镜的光学与结构特点：
四、相差显微镜
（一）基本原理
（二）配置
（三）操作
（四）相差图像特点及相差装置进展：

第三节 特殊光学显微镜技术
一、暗视野显微镜
（一）暗视野显微镜的基本原理：
（二）暗视野显微镜的组成
（三）图像特点：
（四）安装与调试
（五）应用
二、近场光学显微镜
（一）近场光学显微镜的基本原理
（二）近场光学显微镜的基本结构
（三）近场光学显微镜的应用
三、原子力显微镜
（一）原子力显微镜的基本原理
（二）原子力显微镜的组成
（三）原子力显微镜的工作模式
（四）原子力显微镜的应用

第四节 激光扫描共聚焦显微镜
一、激光扫描共聚焦显微镜的基本原理
二、激光扫描共聚焦显微镜的主要特点
三、激光扫描共聚焦显微镜的主要应用
四、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构
五、激光扫描共聚焦显微镜的主要操作步骤
六、双光子（多光子）激光共聚焦显微镜

第五节 显微镜摄影与显微摄影技术
一、显微摄影的基本原理
二、显微镜摄影中CCD的选择
三、显微摄影技术应用
四、CCD成像的操作步骤

第六节 图像分析技术
一、图像分析处理的基本概念
（一）图像处理和计算机图形
（二）计算机图像分析处理的特点
（三）图像处理的算法形式
（四）图像的特征提取
二、图像分析系统的基本配置
（一）图像分析系统的构成
（二）图像分析系统的基本软件
三、图像分析的医学应用
（一）图像分析的图像来源
（二）图像分析的基本内容
（三）医学图像分析的常用分析软件

主要参考文献

《组织学与胚胎学实验技术》
第二章 显微镜技术

第一节 光学显微镜技术概述

显微镜是观察组织微细结构不可缺少的精密仪器。显微镜的种类很多、型号各异。除普通光学显微镜外，还有各种功能的显微镜，如荧光、倒置、相差、暗视野等各大类。

第二节 常规光学显微镜技术

一、普通光学显微镜
普通光学显微镜（light microscope）是最常用的观察组织切片的工具，机体各部分的微细结构必须用显微镜才能进行观察。显微镜包括光学、照明和机械三个系统，光学系统主要决定显微镜的质量好坏，它由目镜、物镜和聚光镜等组成。

（一）显微镜的几何光学成像原理
1. 有限远光学系统成像原理

图2-1 有限远光学系统成像原理图 尼康YS100教学显微镜

图2-1为有限远光学系统成像原理图及其相应产品，图中L1为物镜，L2为目镜，AB为标本，A′B′为物镜放大的实像，A〞B〞为眼睛看到的由目镜放大的虚像。A〞B〞离眼睛的距离为250mm至∞，该距离因人而异，通过微量调节物镜L1与标本AB的距离，以达到A〞B〞离眼睛最舒适的距离要求。
2. 无限远光学系统成像原理

图2-2 无限远光学系统成像原理图 尼康研究级80i万能显微镜

图2-2 无限远光学系统成像原理图及其相应产品，图中标本AB所发出光线经物镜L1后，不再会聚成像而以平行光束射向LT, A′B′为光线经LT后放大的实像，A〞B〞为眼睛看到的由目镜放大的虚像。
无限远光学系统可以得到很好的平坦图像，由此目镜视野得以放大，又由于平行光路中加入各类附件方便，功能延展性好，因此高档显微镜均采用此光学系统。
LT称为镜筒透镜，安装于显微镜双目观察镜筒光线入口处。
有限远光学系统物镜与无限远光学系统物镜不能互换。
无限远光学系统明场图像

（二）物镜
物镜（objective）是显微镜最重要的光学部件，它直接影响成像质量和各项光学技术参数，是衡量一台显微镜质量的主要标准。来自标本的光线经物镜第一次放大与经目镜第二次放大后被眼睛接受，又称复式放大，在图像放大的传递中，第一次放大的作用是至关重要的，因此其成像疵病（像差）会被后级镜头传递与放大。
1. 物镜数值孔径：
数值孔径由下式表示：
N．A=n·Sin U
式中：n为物镜前片与标本之间的介质的折射率，U 为光线射入物镜的孔径角。
N．A越大，表征U越大，射进物镜的光通量越大，图像亮度也越大。
油浸物镜需要在物镜前片与标本之间滴香柏油，香柏油的折射率为1.515，从而提高了油浸物镜的N．A。 图2-3数值孔径示意图
2. 物镜的分辨率
分辨率（resolution）又称解像力，指在25cm明视距离处能分辨清楚的两点之间的最小距离。辨认两点之间的距离愈小，分辨本领愈高，人眼的分辨率约为0.2mm；显微镜物镜的分辨率R即是显微镜的分辨率，取决于光的波长，数值孔径以及介质的折射率，用公式表示为：
R=0.61λ/ N．A=0.61λ/ n·Sin U
物镜数值孔径越大，R降低，分辨距离缩小，分辨率好。两只同等倍率的物镜，N．A大者为佳。
3. 放大率
放大率（magnification）又称放大倍数，是指被检验标本经物镜放大，再经目镜或摄影目镜放大后，人眼所看到的最终图像的大小与原物体的比值，是物镜和目镜（或摄影目镜）放大倍数的乘积，可用公式表示为：
M：总放大倍数
M＝ml×m2（×m3）

ml：物镜的放大倍数
m2：目镜或摄影目镜的放大倍率
m3：中间放大倍率
4. 物镜分类与物镜外壳标志示例：
根据物镜像差校正程度，物镜可分为：
（1） 消色差物镜：外壳上标有“Ach”字样或不加任何消像差标记，其像差校正程度，可满足显微镜的基本要求。
（2） 平场消色差物镜：外壳上标有“Plan”字样，在消色差物镜的基础上，增加了视野平坦度效果。
（3） 半复消色差物镜：是等级介于平场消色差与复消色差物镜之间的一种物镜，常被采用于高档显微镜上。
（4） 复消色差物镜：外壳上标有“APO”字样，是像差校正最为完善的物镜，应用于研究级显微镜，但其光学镜片材料中由于加入了多种稀有元素，导致镜片材料稳定性差，光学工艺复杂，镜头价格昂贵。

图2-4 物镜标记示例

（a） 消色差10×物镜，N．A 0.25，机械筒长160mm（有限远光学系统），盖玻片厚度无严格要求，0～0.17mm均可。
（b） 平场消色差40×物镜，N．A 0.65，适用于无限远光学系统，盖玻片厚度0.17mm。
（c） 复消色差100×物镜，N．A 1.40，油浸，无限远光学系统，盖玻片厚度0.17mm。
（三）显微镜的照明聚光镜
1. 聚光镜
聚光镜（condenser）又称聚光器，其作用在于将光源发散的光，有效地聚集在标本上，以产生与物镜相适应的光束，造成一个明亮而又均匀的视场。它同时影响分辨率、对比度、景深和光亮度，而这些因素直接影响显微成像的质量，因此，聚光镜的作用非常重要。
2. 聚光镜照明光路

图2-5 照明光路图
聚光镜紧挨于标本下方，用于集中光源来的光线，使被观察的标本得到明亮、均匀的照明。由聚光镜射向标本光线的孔径角应与物镜孔径角U匹配（图2-5），以发挥物镜数值孔径与分辨率的作用。
3. 聚光镜品种
根据对聚光镜消除像差的程度，当前有阿贝聚光镜，消色差聚光镜及消色差/消球差聚光三个等级，后两者由于对像差作了很好处理，可以使照明光线更好会聚，从而提高了照明亮度，降低杂散光。
从结构外形上，聚光镜有非旋出式及旋出式两类，当旋出式聚光镜的上透镜旋出光路时，还可以满足低倍物镜的大视野照明要求。
此外，还有相衬聚光镜，暗视野聚光镜，DIC聚光镜，低倍聚光镜，长工作距聚光镜等特种聚光镜。

（四）视场光阑与孔径光阑
视场光阑（field diaphragm）和孔径光阑（aperture diaphragm）是显微镜上的两个重要装置，在镜检时，尤其在显微摄影中，它们对获得清晰的物像和高质量的显微照片发挥重要的作用。
1. 视场光阑
视场光阑一般都装在正置显微镜主机的底座上，作用主要是根据不同倍率的物镜，对视场照明范围进行调节，即控制照野，提高显微成像的清晰度。如果视场光阑过大，其照野超过视场直径，视场以外的光线经玻璃和标本的反射和不规则的散射，可造成影像反差减弱，降低影像的清晰度。反之，光阑收缩过小，其视野小于现场直径时，则视野四周被遮挡，不能观察和拍摄到全部物像。
视场光阑的调节方法:
（1）将视场光阑收缩到最小位置，在标本平面中心处看到一个呈正多边形的光斑，此为视场光阑的像。
（2）通过升降聚光镜完成视场光阑的对焦。
2. 孔径光阑
孔径光阑通常与聚光镜联成一体，位于聚光镜前焦面，当孔径光阑收小时（图2-5b），会遮挡住一部分光源来的光线，使照明孔径角U减小，对于4×，10×这类低倍物镜，小孔径照明对提高成像质量有利。这是因为低倍物镜本身的N．A低，若采用大孔径角照明光线，该光线会射在物镜镜筒内壁而产生大量杂散光，这些杂散光是所谓的非成像光线，进入目镜视野会降低图像衬度。
从光学理论分析，通过镜片边缘部分成像光线所产生的像差，远比中心区域的大，因而当物镜镜片边缘部分由于光线通过而参与成像时，图像像差会明显增加。
由上分析可知，当显微镜用高倍物镜观察时（40×，100×），孔径光阑孔应开大，反之则收小。孔径光阑孔的开大、收小应兼顾到图像的分辨率及像差影响。
设置显微镜孔径光阑的目的不是用于调节图像亮度，图像亮度应由照明灯源的电压来控制。
调节孔径光阑的三种方法：
（1）先将标本调准焦点后，从双目镜筒中抽出一个观察目镜，通过镜筒直接观看孔径光阑的像，对孔径光阑进行调节。这种方法直观，可直接看到孔径光阑的变化，但需注意抽出目镜时勿让灰尘落入镜筒内。
（2）根据所用物镜的数值孔径，经计算后，将孔径光圈拨杆定在聚光镜数值孔径标记的相应位置。这种方法简便易行，对显微镜无危害。
（3）可以通过调焦目镜边观察影像，边调整孔径光阑。当影像的反差、景深和清晰度处于最佳状态时停止。这种方法操作简便，调节迅速，但是掌握这种方法并准确无误的调试，必须具备丰富的显微摄影实践经验。

（五）目镜
目镜（eye lens）因靠近观察者的眼睛，故因此得名。其安装在镜筒的上端，各种目镜的口径尺寸均相同，根据需要可以互换。目镜的作用是放大物镜所产生的初级影像，同时校正物镜成像中的像差、色差和照度，使初级影像形成可见的虚像。目镜只起放大镜的作用，并不增加显微镜的分辨率。有些目镜内装有测微尺或指针，用于显微镜测量或指示。

（六）普通光学显微镜的操作要点：
1. 显微镜上的各光学部件必须位于同一轴线上——光轴，才能充分发挥显微镜的光学性能，因此一旦发现显微镜的图像异常，例如视野里图像半边亮、半边暗等情况，应仔细检查显微镜的各部件是否安装到位。
2. 应熟练掌握孔径光阑与视场光阑的操作，孔径光阑孔大小的理想尺寸，应是使照明光线的孔径角为物镜理论孔径角的70%，拔下目镜，通过目镜筒可以看到孔径光阑孔在物镜后焦面的影像，光阑孔的大小应是物镜通光孔的70%。
3. 油浸物镜使用后，应及时去除物镜前片的香柏油渍，用擦镜纸蘸少量乙醚（70%）与乙醇（30%）的混合液来擦除。
4. 手指不要触及光学零件表面，用上法可以消除光学件表面的油污。
5. 显微镜保管不当会导致光学零件生霉，贮存环境应当是干燥、无高温、无腐蚀气体的地方。

二、荧光显微镜
（一）荧光的基础知识
1.荧光

图2-6 荧光示意图
在光的照射下，具有荧光特性的物质的电子在吸收能量后，可由低能级电子层跃迁到高能级电子层。高能态的电子是不稳定的，它会在极短的时间内（10-8s），以辐射光的形式释放能量后，回到原来的能态。这时发出的光即为荧光（fluorescence），其波长比激发光的波长要长，原理如图2-6所示。利用物质对光吸收的高度选择性，可制成各种滤片，吸收一定波长范围的光或允许特定波长的光通过，用来激发不同的荧光素，产生不同颜色的荧光（表2-1）。

表2-1 荧光显微镜中常用光的波长与颜色的关系
光谱范围
波长范围（nm）
光谱颜色
光谱范围
波长范围（nm）
光谱颜色
紫外光区
＜390
肉眼不可见

500～570
绿色
可见光区
390～430
紫色

570～600
黄色

430～450
蓝色

600～630
橙色

450～500
青色

630～670
红色

2.荧光物质的特性和种类
荧光物质（fluorescent）又称荧光素（fluorescein或luciferin）、荧光色素或荧光探针，是指能够吸收光并能在较短时间内发射荧光，并且能作为燃料的化合物。荧光素通常具有芳香环结构。
（1）荧光物质的特性：
1）荧光效率 荧光色素能发出荧光，除具备合适的能量外，还需具备高荧光效率。荧光效率（fluorescence efficiency）即荧光量子产率，是指荧光物质吸收光后发射出的荧光光量子数与其吸收激发光量子数之比。
荧光量子产率数值反映了荧光物质将吸收的光能转化为荧光的效率，其数值越大，该物质的荧光越强，用于荧光分析的荧光物质荧光量子产率数值要求达到0.35以上。大部分物质没有发射荧光的性质，即使是荧光色素也不能将吸收的光全部转变为荧光，而是在发射荧光的同时，或多或少地以其他形式释放其所吸收的光能。因此，荧光量子产率数值在通常情况下总是小于1。
2）荧光强度 荧光强度（fluorescence intensity）是指荧光色素发射荧光的光量子数，它决定荧光色素检测的灵敏度。在一定范围内，激发光越强，荧光也越强，即荧光强度等于吸收光强度乘以荧光效率。所以，选用适当强度的光源作为激发光源和选用适合于被检荧光物质选择吸收的光谱滤片作为激发滤片，是提高荧光强度的根本方法。
3）荧光物质的吸收光谱和发射光谱 每种荧光物质的吸收光不仅有一定波长，而且在各波长的吸收量也不同，从而构成特殊的吸收光谱曲线；发射荧光的情况也类似。因此，荧光物质在一定条件下有一定的吸收光谱（激发光谱）和发射光谱（荧光光谱），如吖啶橙与不同细胞成分结合后，可产生橙、黄、红、绿等不同颜色的荧光。

图2-7 斯托克位移
大多数荧光物质的激发光波长处于紫外或可见光区域，发射光波长处于可见光区域。荧光物质的发射波长总是大于激发光波长，两者之间的差值叫斯托克位移（Stocks shift）（图2-7）。在荧光显微镜的应用中，就是通过斯托克位移现象将激发光与发射光分离出来，只检测发射光，从而提高检测的灵敏度。
4）荧光稳定性 一般情况下，提高激发光强度可以提高荧光强度，但是激发光的强度不可能无限度提高。因为当激发光强度超过一定强度时，光吸收趋于饱和，而且将不可逆地破坏激发态分子，引起光漂白现象，严重影响检测。解决光漂白问题最直接的方法是降低光照强度和使用抗淬灭剂（anti-fade reagent）。
5）荧光色素分子对环境的敏感性 荧光色素的荧光光谱和量子产率受环境影响，这也是众多荧光素具有探针作用的基础。其影响因素主要有：
① 荧光色素染液的pH值 荧光色素是否发射荧光以及辐射何种荧光与其在溶液中存在的状态具有重要关联。荧光色素均含有酸性或碱性助色团，溶液的酸碱性对它们的电离有影响，而且每种荧光都有其最适pH值。如1-萘酚-6-磺酸在pH6.4～7.4的溶液中发射蓝色荧光，但当pH＜6.4时则不发射荧光。
② 温度 荧光色素的荧光量子产率和荧光强度通常随溶液温度的降低而增加，如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光量子产率增加3％。降至-80℃时，荧光量子产率接近100％；反之则减弱，甚至导致荧光淬灭。一般情况下，在20℃以下荧光量子产率随温度变化不明显，故在进行荧光染色过程中需控制温度。
③ 溶剂性质对荧光素的影响 同种荧光素在不同性质的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度均有明显差别，在荧光染色时常需要根据所需要的pH值缓冲液配制染液。
④ 荧光素浓度的影响 荧光素浓度对荧光强度的影响更明显。在稀溶液中，荧光强度与荧光素的浓度呈线性关系；浓度增加到一定程度后，荧光强度保持恒定，即便再增加浓度，荧光强度也不发生变化；若浓度继续增加，超过一定限度后，由于荧光物质分子间的相互作用引起自身荧光淬灭现象，使荧光强度随浓度的增加反而减弱。荧光素染色的应用浓度一般为10-3～10-5mol/L。
总而言之，在进行荧光探针实验时，应注意合适的pH值、温度、溶剂和荧光素浓度等条件。另外，染色液最好新鲜配制，先配制高浓度储存液，临用前再稀释，避免因储存时间过长而失效。
6）荧光的淬灭及抗淬灭
① 荧光的淬灭 荧光淬灭（quench）是指荧光分子由内部因素和外部因素同时作用造成的不可逆破坏。内部因素主要是分子从激发态回到基态，以非辐射跃迁形式释放能量。外部因素包含多方面，主要有：（a）光照射是致荧光淬灭的最常见原因，荧光的产生需要光照射，但同时光照射也会促进激发态分子与其他分子相互作用而引起碰撞，使荧光淬灭；（b） 荧光物质的分子与外部分子（或离子）形成非荧光的化合物；（c） 共振能量转移；（d） 溶剂种类、pH值和温度等。
能够引起荧光淬灭的物质称为淬灭剂，如卤素离子、重金属离子、具有氧化性的有机化合物以及氧分子等。
② 荧光的抗淬灭 标记样品的荧光淬灭是荧光操作时遇到的主要问题，由于光漂白作用，荧光素的荧光在连续观察过程中逐渐减弱或消失，因此需考虑使用抗荧光淬灭剂。常用的抗淬灭剂有p-苯二胺（para-phenylene diamine, PPD）、n-丙基没食子酸盐（n-propyl gallate, NPG）、1，4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷（1，4-diazobicyclo[2,2,2]-octane, DABCO）等。其中PPD是最有效的抗淬灭剂，但由于其对光和热有较强的敏感性，且具有毒性，因而限制了其在生物体内的应用。理想的抗淬灭剂混合液配方是：9份甘油、1份PBS和浓度在2～7mmol/L之间的PPD，最终pH为8.5～9.0。NPG无毒性，对光和热稳定，但抗荧光漂白的效果不如PPD，可用于体内研究。推荐NPG浓度为3～9mmol/L，用甘油配制效果较好。DABCO是一种稳定的非离子性抗淬灭剂，价格便宜且易使用，可用于体内研究。
（2）常用的荧光素 常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC）、四乙基罗丹明（tetraethyl rhodamine B200, RB200）、德克萨斯红（Texas red）、藻红蛋白（phycoerythrin, PE）、花青类（cyanine，如Cy3、Cy5）以及新型荧光燃料（如量子点）等。
1）异硫氰酸荧光素（FITC） FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织、细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光的影响。最大激发光波长为490nm；最大发射波长为525nm，呈现黄绿色荧光。
2）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定，生理条件下对pH值变化不明显，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫组织化学双重染色。
3）四乙基罗丹明（RB200） 可与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，可长期保存，广泛用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橙红色荧光。
4）花青类染料 常用的是Cy3、Cy5，能与细胞内蛋白质结合。此类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但其水溶性和对光稳定性较强，对pH等环境不敏感，荧光量子产率较高，常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿色光谱波长激发Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，故普通荧光显微镜观察时不推荐使用Cy5。
5）乙酸乙酯 本身不发荧光，但当其透过膜进入细胞质后，在酯酶作用下转变为具有荧光特性的乙酸乙酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈现绿色荧光。
6）Indo-1 是典型的双发射荧光探针，无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度呈线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度。因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发波长为330/346nm，最大发射光波长为405/ 485nm，呈紫色（405nm）或青色（485nm）荧光。
7）量子点 量子点（quantum dot）是近年来研制的新型荧光染料，又称半导体纳米晶体（semiconductor nanocrystal），是由几百个或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长，可产生多种颜色，检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时到多种颜色，因而可以同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，用于检测靶分子的分布和功能。

（二）荧光显微镜
荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用一定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜进行观察。这样在高对比度的背景下，即使荧光很微弱也易辨认，灵敏度高。所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。由此可知，荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。
Reichert在1911年设计了第一台荧光显微镜，之后，通过荧光染色方法和荧光装置的改进，特别是荧光抗体技术的建立和激发光源及滤色片系统的发展，使荧光显微镜技术在细胞学、微生物学、组织胚胎学、免疫学等多个学科得到了广泛的应用。荧光显微镜主要的应用包括：① 通过免疫荧光标记（单标、双标或三标）进行如细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布，两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位分析；② 细胞凋亡机制的研究；③ 荧光原位杂交（FISH）, 染色体基因定位；④ 细胞骨架装配：分析正常及癌变细胞中细胞骨架与核改变之间的关系；⑤ 细胞黏附行为；⑥ 通过离子探针可进行细胞内钙、镁、钠离子和pH值的测量。
1.荧光显微镜的分类
按高压光源的激发光路不同，分为落射（反射）荧光显微镜和透射荧光显微镜（图2-8）。新型落射光装置是来自光源的光照射到干涉分光滤镜后，波长短的紫外光和蓝紫光由于滤镜上镀膜的性质而反射，当滤镜对光源呈45°倾斜时，光便垂直射向物镜，经物镜射向标本，使标本中的荧光物质收到激发，这时物镜直接起到聚光器的作用。同时，波长长的部分光（绿、黄、红等）对滤镜是可透的，不向物镜方向反射。因此，滤器起激发滤板的作用。由于标本的荧光处在可见光波长区，可透射滤镜到达目镜而被观察到。透镜荧光显微镜的激发光束来自载物台下方，经聚光器射向标本，使标本中的荧光物质受到激发。前者荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高，在高放大倍数时比透射光源强。新研制的荧光显微镜多采用落射光装置，称之落射荧光显微镜。

图2-8 落射荧光显微镜和透射荧光显微镜激发光路比较图
（a）落射荧光显微镜 （b）透射荧光显微镜
按结构形式分为正置式荧光显微镜和倒置式荧光显微镜。正置式荧光显微镜可满足样品制成薄片后的观察方式，既可作为普通显微镜使用，也可做荧光观察。倒置荧光显微镜和正置荧光显微镜的区别在于物镜与照明系统颠倒，前者物镜在载物台之下，后者物镜在载物台之上。倒置荧光显微镜能观察各种活细胞，通常用于培养细胞的观察。

2.荧光显微镜的结构
荧光显微镜的主要由照明系统、滤光片系统、荧光光学部件等核心的三部分构成（图2-9）：
（1）照明系统：
荧光显微镜的照明光源传统常用的是汞灯和氙灯。
汞灯发射光谱的波长范围在200～650nm之间，且有多个高能量发射峰，足以激发目前常用的荧光物质，因此在荧光显微镜被普遍采用。汞灯启动时需要高压激发，启动后维持在一个较低的工作电压。常用的汞灯为103W，平均工作寿命为200h。超过200h后，其光效率会降低很多。在汞灯使用过程中需要注意：汞灯工作后至少需要开启15min以上，关闭后至少间隔15min以上，待汞灯冷却后才能再次开启。

图2-9 尼康正置荧光显微镜结构
图2-10 尼康新型荧光光源

现在市场上流行的荧光光源有着较长的工作寿命，如达2000h以上的金属卤化物灯，并且在开启和关闭时有自我保护装置，不存在常规汞灯使用时的时间间隔影响。这种荧光光源通过光纤与显微镜连接，且带有光闸。图2-9为尼康公司的长寿命荧光光源。
由于荧光光源比较强尤其是紫外区域的光线，故在开启时不要用眼睛直视光源。
（2）滤光片系统：
图2-11 滤光片结构
滤光片系统是荧光显微镜的重要组成部分，由激发滤色片（excitation filter）、发射滤色片（barrier filter）和二向色镜（dichroic mirror）组成（图2-11）。
激发滤色片位于光源和显微镜之间的光路内，其作用是将照明灯发出的全波段光过滤成激发样品荧光所需波段的光。过滤后的光经二色镜反射至样品以激发其荧光。滤去其他波长的光有四个作用：① 降低背景亮度；② 防止干扰荧光体被激发产生杂色荧光；③ 防止待观察样品被强光照射发生荧光淬灭；④ 防止待观察样品被强光照射发生分解。按照透过光的波长带宽，激发滤片可分为宽带型（wide band pass）和窄带型(narrow band pass)，前者透过光的带宽一般在30nm以上，后者在30nm以下。宽带型滤片的光通量大，激发能量强，但若样品中有激发波长在此范围内的多种荧光体，则均被激发而出现干扰荧光；窄带型则相反，激发能量较小，但对荧光体激发的选择性好。
二向色镜上镀有一层铝，铝对紫外光和可见光的蓝紫光吸收较少，反射率可达90％。它的作用是将激发光反射至样品上，并透过样品荧光探针发出的荧光（波长较激发光长），阻挡被玻片及样品反射的紫外或短波激发光进入目镜，保护眼睛和进一步降低背景亮度。
发射滤色片安装在物镜和目镜之间的光路中，它再次过滤已通过二向色镜的光，滤除干扰荧光或杂色荧光，使进入目镜的荧光色调更纯，以获得清楚的荧光影像和保护观察者的眼睛。发射滤色片按透光波长分为带通（band pass,BP）和长通（long pass, LP），前者只透过一个波段的光，后者可透过比标明波长更长的光。
图2-12 三色荧光标记样品
荧光滤光片按激发滤色片和发射滤色片的光波段数还可分为单色、双色和三色，经这些滤光片过滤后的光分别为一个、两个和三个分立的波段，后二者分别用于含有两种或三种不同激发和发射波长荧光探针的样品，用以同时观察多种荧光（图2-12）。此外，针对各种高级荧光应用还通常配置各种荧光探针的专用滤光片，以期达到最佳的荧光效果。因此选择荧光显微镜的一个关键是正确选择荧光滤光片组。
（3）荧光光学部件
在荧光显微镜中使用的光学部件（物镜和目镜）采用了特殊的光学材料——石英，防止吸收紫外光线，同时为了消除色差的影响，光学部件都采用了多层透镜组合。
在荧光显微镜的物镜选择上，大多要采用专用的荧光物镜，即半复消色差物镜，对于一些高级荧光应用还需选择自身荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光的全复消色差物镜或者超级荧光物镜，。一般物镜的规格有4×，10×，20×，40×，60×或63×，100×。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜数值孔径的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为提高荧光图像的亮度，荧光显微镜需使用数值孔径大的物镜。同一倍数下，荧光显微镜物镜的数值孔径（N.A.）要高于常规明场显微镜的物镜，从而可以得到更高分辨率的成像。专为荧光显微镜设计制作的聚光镜分明视野聚光镜和暗视野聚光镜两种，在一般荧光显微镜上多采用明视野聚光镜，它具有聚光力强、使用方便等特点，特别适用于低、中倍放大的标本观察。暗视野聚光镜在荧光显微镜中的应用也日益广泛。
在制备荧光切片或者活细胞培养时，要选择使用无自发荧光的玻片和培养皿。同时，在使用高倍油镜时，要使用无自发荧光的浸油，以免因这些物体的自发荧光而影响最后的成像效果。
另外，对于荧光图像的采集，一般选择带制冷的单色CCD作为最佳选择。对此，在后面的章节中会叙述。

（三）荧光显微镜的基本操作步骤
1.打开荧光显微镜的照明光源（若为汞灯光源，需先打开汞灯控制器开关，再按下高压激发按钮；若为长寿命荧光光源，则只需打开控制器开关即可）；
2.把荧光显微镜物镜转换器上的荧光对中镜转到光路，通过调节汞灯前方的集光镜直至荧光对中镜上显示清晰的汞灯像，接着调节汞灯灯室上的方向调节旋钮直至汞灯像处于荧光对中镜的中心（一般此步操作在安装汞灯时进行一次调节后就可以了，若照明光源为长寿命荧光光源则不需此步骤）；
3.将标记了荧光探针的样品置于载物台上；
4.选择所需倍数的物镜，转动将其对准光路；
5.选择所需的荧光滤光片，转动将其对准光路；
6.打开荧光光路的光闸；
7.通过调整粗、微调旋钮，调整焦距。

（四）荧光显微镜的操作注意事项
1.因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含有紫外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。
2.为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15 min后才能关闭。
3.汞灯熄灭后,待其完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸汽尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电极，更重要的是汞蒸气的溢出，会导致工作室的污染。故关闭汞灯之后不能马上再次打开，必须等待至少30 min。
4.高压汞灯工作室会散出大量的热量，因此，工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。
5.汞灯使用寿命约200～300 h，在电源控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计小时数，达到300 h需更换新灯泡，否则亮度不够将影响观察。

（五）荧光显微镜标本制作特点和观察要求
1.载玻片 载玻片厚度应在0.8～1.2 mm之间，玻片太厚吸收光多，激发光难以在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
2.盖玻片 盖玻片厚度应约0.17 mm，光洁。为加强激发光也可用干涉盖玻片，这种特制盖玻片的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁），它可以使荧光顺利通过而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本中的荧光。
3.标本 组织切片或其他标本不能太厚，一般以5～20 mm为宜，切片太厚可使激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察的标本上部不能被激发。切片折叠或杂质过多均可影响荧光的观察。
4.封片剂 封片剂必须无自发荧光、无色透明。加上抗淬灭剂后再用指甲油（实际操作中指甲油封片效果很好，可做到薄而均匀）将盖玻片四周封固，既保持盖玻片不滑动，又能防止抗淬灭剂的蒸发。在没有抗淬灭剂的情况下，也可使用含30％甘油的PBS，还可用甘油与0.5 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.0～9.5）等量混合液作封片剂。
5.镜头的清洁 在油镜使用完毕后，需用擦镜纸沾上无水乙醇或醇醚混合液（3：7）轻轻擦拭。
6.及时观察 标本染色后应及时观察，因时间过长荧光会逐渐减弱。若标本放在聚乙烯塑料袋中置于4℃保存，可延缓荧光减弱时间。

三、倒置显微镜
（一）用途：
倒置显微镜是为观察研究培养皿内的细胞、组织而设计制造的，其造型特点是标本置于物镜上方，照明光线自上朝下走向，物镜朝上；从人机关系学的观点出发，这样的造型设置有利于显微镜操作者在显微镜上长时间工作。
（二）V型与U型倒置显微镜

（a） （b）
图2-13 倒置显微镜外形
图2-13（a）为“V”型造型的倒置显微镜，来自物镜成像光线只经过一次反射即到达目镜，光学系统简洁，像质好，是一种普及型产品。
图2-13（b）为“U”型造型的倒置显微镜，来自物镜的成像光线在显微镜基座底部像“U”字母样被折拐两次，光线先往下，后再折拐朝上。这样设置的好处是可以把物镜转换器的空间腾出来，便于添加各类功能附件，使产品具有很好延展性，是一种研究型显微镜。
（三）倒置显微镜的光学与结构特点：
1. 物镜：倒置显微镜的物镜应对培养皿玻壳厚度1.2 mm校正好像差，其物镜工作距离应大于玻壳厚度——长工作距，高级物镜还带有盖玻片校正环，适应不同培养皿玻壳厚度的像差校正。
2. 长工作距聚光镜：便于在显微镜载物台上有足够空间来安置培养皿与显微操作器。
3. 光学系统必须有相差功能，因为培养皿内的细胞多是不染色的。
4. 倒置显微镜上可汇集当代所有的显微术与最先进的仪器结构，如：荧光、相差、光导纤维照明、激光共聚焦、全自动控制、全内反射、恒温、热台、显微操作器，是生命科学研究中重要的实验室设备。

四、相差显微镜：
其另一个名称是“相衬显微镜”。相差显微镜是光学显微镜发展史上的一项创新技术。19世纪30年代荷兰物理学家Zernike首先设计，并于1942年制造了第1台相差显微镜。由于此项发明，Zernike于1953年获诺贝尔奖。
（一）基本原理
人的眼睛只能鉴别可见光波长（颜色）和振幅（强度）的变化，不能鉴别相位的变化。但是大多数活的生物样品高度透明，光波通过后振幅基本不变，却存在相位的变化，只是人的眼睛感觉不到。Zernike设计的相差显微镜，能将人眼看不见的样品本身的相位差（或光程差）转变为人眼能看见的振幅（光强度）变化。

通过相差显微镜示意图2-14中可以看出，相差显微镜与一般显微镜结构上不同之处在于：相差显