中药成分测定方法.ppt

中药成分测定方法中药成分测定方法第一节第一节 含量测定目标与意义含量测定目标与意义 中药含量测定与化药有很大区分中药含量测定与化药有很大区分中药组成复杂，产生疗效不是某单一成份，中药组成复杂，产生疗效不是某单一成份，检测任何检测任何一个活性成份均不能反应中药整体疗效一个活性成份均不能反应中药整体疗效。不过借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味有效成不过借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味有效成份、活性成份、指标性成份含量方法，对于份、活性成份、指标性成份含量方法，对于控制中药控制中药质量起着不可替换主要作用质量起着不可替换主要作用。经过测定中药中有效成份、毒性成份或一些指标性成经过测定中药中有效成份、毒性成份或一些指标性成份含量来份含量来衡量其制剂工艺稳定性和中药材质量优劣衡量其制剂工艺稳定性和中药材质量优劣，以确保中药质量，到达临床用药安全、有效目标。以确保中药质量，到达临床用药安全、有效目标。中药成分测定方法2/922第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 样品处理主要作用有：样品处理主要作用有：将被测成份有效地从样品中释放出来，并制成便于将被测成份有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定稳定试样。分析测定稳定试样。除去杂质、纯化样品，以提升分析方法重现性和准除去杂质、纯化样品，以提升分析方法重现性和准确度。确度。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成份。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成份。衍生化不但可提升检测器灵敏度，还能够提升方法选择衍生化不但可提升检测器灵敏度，还能够提升方法选择性。性。使试样形式及所用溶剂符合分析测定要求。使试样形式及所用溶剂符合分析测定要求。中药成分测定方法3/923第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 一、样品粉碎一、样品粉碎 1.1.目标目标：是确保含量测定所取样品均匀而有代表性，提升测定结果精是确保含量测定所取样品均匀而有代表性，提升测定结果精密度和准确度；密度和准确度；是使样品中被测组分能更加快地完全提取出来。是使样品中被测组分能更加快地完全提取出来。2.2.粉碎时粉碎时注意事项注意事项：不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，所以可视实际情况进行粉碎过筛。过滤困难，所以可视实际情况进行粉碎过筛。防止污染样品。在粉碎样品时，要尽可能防止因为设备磨损防止污染样品。在粉碎样品时，要尽可能防止因为设备磨损或不洁净等原因而玷污样品，或不洁净等原因而玷污样品，预防粉尘飞散或挥发性成份损失。预防粉尘飞散或挥发性成份损失。过筛时，通不过筛孔部分颗粒决不能丢弃，必须重复粉碎或过筛时，通不过筛孔部分颗粒决不能丢弃，必须重复粉碎或碾磨，让其全部经过筛孔。碾磨，让其全部经过筛孔。中药成分测定方法4/924第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 二、样品提取二、样品提取 对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和一些量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和一些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。分离后，再对被测组分进行含量测定。常见提取方法常见提取方法：Y 冷浸法冷浸法 Y 回流提取法回流提取法 Y 连续回流提取法连续回流提取法 Y 超声提取法超声提取法 Y 超临界流体提取法超临界流体提取法中药成分测定方法5/925第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 三、样品分离净化三、样品分离净化 （一）沉淀法（一）沉淀法（二）蒸馏法（二）蒸馏法 （三）液一液萃取法（三）液一液萃取法（LLELLE）（四）色谱法（四）色谱法 中药成分测定方法6/926第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理（四）色谱法（四）色谱法 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和药制剂分析中净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。纸色谱。其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液固萃取（固萃取（LSELSE）含有）含有设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最惯用，将在此做设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最惯用，将在此做一介绍。一介绍。LSE LSE通常是指样品溶液加到装有适当固定相（净化剂）长通常是指样品溶液加到装有适当固定相（净化剂）长5515cm15cm，内径，内径0.50.51cm1cm色谱柱中，将被测成份保留于柱上，洗去杂色谱柱中，将被测成份保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成份进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，质后，再洗脱被测成份进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成份进行测定。用这种选择性好而柱效较低方法进直接洗脱被测成份进行测定。用这种选择性好而柱效较低方法进行样品净化分离，尤其适合用于一类总成份含量测定，也可将色行样品净化分离，尤其适合用于一类总成份含量测定，也可将色谱柱流出样品深入用谱柱流出样品深入用GCGC、HPLCHPLC、TCLTCL分离后测定。分离后测定。LSE LSE惯用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、惯用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶C8C8、C18C18、聚酰胺等。、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。中药成分测定方法7/927第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 硅胶、氧化铝等：硅胶、氧化铝等：它们是传统吸附剂，多以它们是传统吸附剂，多以0.070.070.15mm0.15mm(200(200100100目目)颗粒颗粒1 15g5g用于样品净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面极用于样品净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面极性吸附作用。通常是当性吸附作用。通常是当溶于有机溶剂样品溶于有机溶剂样品加到柱上时非极性或加到柱上时非极性或低极性杂质先被洗出低极性杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性溶剂洗脱被测成份，色谱柱，再用适当极性溶剂洗脱被测成份，而强极性杂质仍保留在柱上。而强极性杂质仍保留在柱上。氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等测定。氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等测定。比如用法（吸收系数法）比如用法（吸收系数法）硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大溶剂洗脱，则若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大溶剂洗脱，则能够将杂质和被测成份分离。能够将杂质和被测成份分离。中药成分测定方法8/928键合相硅胶：键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（简称十八烷基键合相硅胶（简称C18C18或或ODSODS）是惯用固体萃取剂，）是惯用固体萃取剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成份。也惯用于萃取，纯化水基质体液中憎水性药溶性杂质或成份。也惯用于萃取，纯化水基质体液中憎水性药品。该类品。该类LSELSE普通操作程序为：普通操作程序为：1)1)柱活化。用柱活化。用2ml2ml甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用0.50.5毫毫升水洗去柱中甲醇。升水洗去柱中甲醇。2)2)上样。上样。3)3)清洗。用清洗。用2 25ml5ml水水清洗以清洗以除去弱保留亲水成份除去弱保留亲水成份，如无机盐、氨，如无机盐、氨基酸、亲水蛋白质、糖以及中等保留成份极性化合物、低肽等。基酸、亲水蛋白质、糖以及中等保留成份极性化合物、低肽等。4)4)洗脱。用洗脱。用2 25ml5ml甲醇或甲醇甲醇或甲醇-水洗脱水洗脱大分子肽、甾体、较亲脂药大分子肽、甾体、较亲脂药品等强保留待测组分。品等强保留待测组分。第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 中药成分测定方法9/929大孔树脂：它可分为极性和非极性型大孔树脂：它可分为极性和非极性型 极性极性 丙烯酰胺聚合物丙烯酰胺聚合物;非极性非极性 苯乙烯和二乙烯苯共聚物苯乙烯和二乙烯苯共聚物.其吸附性质与烷基键合相硅胶相同，经过疏水作用其吸附性质与烷基键合相硅胶相同，经过疏水作用对非极性水溶性成份有吸附力。比如在测定复方归芪剂对非极性水溶性成份有吸附力。比如在测定复方归芪剂中黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性多糖杂质，再用中黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性多糖杂质，再用30%30%乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂主要特点是表面主动乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂主要特点是表面主动大，传质速率较高和含有不一样极性及适于吸附较大分大，传质速率较高和含有不一样极性及适于吸附较大分子。子。树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用量常为量常为1 12g2g，有时也用，有时也用100100150mg150mg来萃取血、尿中药来萃取血、尿中药品，操作程序类似品，操作程序类似ODSODS填料。填料。第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 中药成分测定方法10/9210第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 聚酰胺：聚酰胺：它是惯用有机吸附剂，主要经过与溶它是惯用有机吸附剂，主要经过与溶质形成氢键而产生吸附作用。质形成氢键而产生吸附作用。惯用于含酚、酸、醌类药品样品液净惯用于含酚、酸、醌类药品样品液净化分离，化分离，如测定黄酮时，用样品乙醇提取液上如测定黄酮时，用样品乙醇提取液上柱，水洗去部分杂质，以柱，水洗去部分杂质，以95%95%乙醇洗脱总黄乙醇洗脱总黄酮后测定。酮后测定。中药成分测定方法11/9211第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 硅藻土、纤维素：硅藻土、纤维素：它它们们为为惯惯用用亲亲水水型型填填料料，其其原原理理为为分分配配作作用用。填填料料作作为为支支持持剂剂，多多以以水水基基质质液液作作为为固固定定相相，与与水水不不混混溶溶有有机机溶溶剂剂为为流流动动相相，较较亲亲脂脂成成份份从从固固定定相相转转移移到到流流动动相相，而而被被洗洗脱脱，到到达达萃萃取取目目标标。其其萃萃取取率率较较高高（普普通通大大于于80%80%），无无浓浓集集作作用用，萃萃取取液液较较纯纯净净，但但洗洗脱剂用量较大（普通大于脱剂用量较大（普通大于5ml5ml）硅硅藻藻土土柱柱则则用用干干柱柱直直接接上上样样，柱柱可可再再生生。常常见见牌牌号号为为ExtretutExtretut。纤纤维维素素柱柱使使用用与与硅硅藻藻土柱相同。土柱相同。中药成分测定方法12/9212离子交换树脂：离子交换树脂：憎水基质离子交换树脂兼有离子交换剂憎水基质离子交换树脂兼有离子交换剂及大孔树脂一些性质，所以对于在水中溶解及大孔树脂一些性质，所以对于在水中溶解度不大药品、洗脱剂中需含一定量有机溶剂。度不大药品、洗脱剂中需含一定量有机溶剂。离子交换树脂柱可用于除去样品中离子，离子交换树脂柱可用于除去样品中离子，预防组分分解，更惯用于萃取样品液中可离预防组分分解，更惯用于萃取样品液中可离解化合物。解化合物。第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 中药成分测定方法13/9213第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 另外，近年来发展起来固相微萃另外，近年来发展起来固相微萃取取(Solid-Phase microextraction,(Solid-Phase microextraction,SPME)SPME)和液相微萃取和液相微萃取(Liquid-Phase(Liquid-Phase microextraction,LPME)microextraction,LPME)技术有良好技术有良好应用前景。应用前景。SPMESPME是一个无溶剂萃取技是一个无溶剂萃取技术，取样方式有直接取样和顶空取样。术，取样方式有直接取样和顶空取样。中药成分测定方法14/9214（五）消化法五）消化法 对样品进行有机破坏，惯用于中药制剂中重金属检验。对样品进行有机破坏，惯用于中药制剂中重金属检验。惯用破坏方法有湿法消化和干法消化法。惯用破坏方法有湿法消化和干法消化法。湿法消化：依据所用试剂不一样，下面介绍三种常见消湿法消化：依据所用试剂不一样，下面介绍三种常见消化方法。化方法。（1 1）硝酸）硝酸高氯酸法高氯酸法 该法破坏能力强，反应较激烈，故该法破坏能力强，反应较激烈，故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中溶液蒸干，以免发生进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中溶液蒸干，以免发生爆炸。本法适合用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制爆炸。本法适合用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含氮剂破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含氮杂环类有机物破坏不够完全。杂环类有机物破坏不够完全。（2 2）硝酸）硝酸硫酸法硫酸法 该法适合用于大多数有机物质破坏，该法适合用于大多数有机物质破坏，无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐金属无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐金属离子测定，不宜采有此法。离子测定，不宜采有此法。第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 中药成分测定方法15/9215第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理（3 3）硫酸）硫酸硫酸盐法硫酸盐法 本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入硫酸盐目标是为了提升硫酸沸点，以使样品破坏加硫酸盐目标是为了提升硫酸沸点，以使样品破坏加速完全。同时预防硫酸在加热过程中过早地分解为速完全。同时预防硫酸在加热过程中过早地分解为SO3SO3而损失。经本法破坏所得金属离子，多为低价而损失。经本法破坏所得金属离子，多为低价态。本法惯用于含砷或锑有机样品破坏，破坏后得态。本法惯用于含砷或锑有机样品破坏，破坏后得到三价砷或锑。到三价砷或锑。湿法消化所用仪器，普通为硅玻璃或硼玻璃制湿法消化所用仪器，普通为硅玻璃或硼玻璃制成凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱成凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去离子水中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白试验校正。或高纯水，同时必须按相同条件进行空白试验校正。操作时应在通风橱内进行。操作时应在通风橱内进行。中药成分测定方法16/9216第二节第二节 含量测定样品处理含量测定样品处理 干法消化干法消化 本法是将有机物灼烧灰化以达分解目标，将适量样品置于本法是将有机物灼烧灰化以达分解目标，将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3Na2CO3或轻质或轻质MgOMgO等以助等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适合用于含易挥发性金炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适合用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品破坏。属（如汞、砷等，）有机样品破坏。应用本法时要注意以下几个问题：应用本法时要注意以下几个问题：1 1）加热灼烧时，控制温度在）加热灼烧时，控制温度在420420以下，以免一些被测金以下，以免一些被测金属化合物挥发。属化合物挥发。2 2）灰化完全是否，直接影响测定结果准确度。如欲检验灰）灰化完全是否，直接影响测定结果准确度。如欲检验灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量稀化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量稀HCl-HCl-水（水（1:31:3）或）或硝酸硝酸-水（水（1:31:3）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。3 3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。去。中药成分测定方法17/9217第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法|分类重量分析和滴定分析。分类重量分析和滴定分析。|化学分析法所用仪器简单，结果准确。化学分析法所用仪器简单，结果准确。|主要用于测定制剂中含量较高一些成份及含主要用于测定制剂中含量较高一些成份及含矿物药制剂中无机成份，如总生物碱类、总酸类、矿物药制剂中无机成份，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。总皂苷及矿物药制剂等。|化学分析法有一定不足，其灵敏度低，操作化学分析法有一定不足，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成份准确繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成份准确性不理想。性不理想。中药成分测定方法18/9218第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法（一）重量分析法（一）重量分析法 重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。1 1、挥发法可测定含有挥发性或能定量转化为挥发性物质、挥发法可测定含有挥发性或能定量转化为挥发性物质组分含量。如：组分含量。如：供试品干燥失重测定；供试品干燥失重测定；水分测定均属挥发水分测定均属挥发法；法；中药制剂分析中灰分及炽灼残渣测定等。中药制剂分析中灰分及炽灼残渣测定等。2 2、萃取法是依据被测组分在互不相溶两相中溶解度不一、萃取法是依据被测组分在互不相溶两相中溶解度不一样，到达分离目标。如样，到达分离目标。如冰硼散中冰片含量测定；冰硼散中冰片含量测定；地奥心血地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；康胶囊中甾体总皂苷含量测定；昆明山海棠片中总生物碱含昆明山海棠片中总生物碱含量测定；量测定；甘草浸膏中甘草酸含量测定即采取萃取法。甘草浸膏中甘草酸含量测定即采取萃取法。3 3、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量方法，适合用于制剂中纯度较高成份。如含量方法，适合用于制剂中纯度较高成份。如西瓜霜润喉片西瓜霜润喉片中西瓜霜含量测定；中西瓜霜含量测定；苦参片中苦参总碱含量测定；苦参片中苦参总碱含量测定；复方元复方元胡注射液总碱测定。胡注射液总碱测定。中药成分测定方法19/9219第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法（二）滴定分析法二）滴定分析法 滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。和氧化还原滴定法。1 1、酸碱滴定法、酸碱滴定法 适合用于测定中药制剂中所含有生物碱、有机酸、内酯适合用于测定中药制剂中所含有生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分含量。类等酸、碱组分含量。直接滴定：对于直接滴定：对于KC10KC10-8-8酸、碱组分，可在水溶液中酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱含量测定、颠茄酊直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱含量测定、颠茄酊中生物碱含量测定。中生物碱含量测定。间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质含间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质含量测定、草乌注射液中生物碱含量测定等。量测定、草乌注射液中生物碱含量测定等。2 2、沉淀滴定法、沉淀滴定法 主要用于生物碱、生物碱氢卤酸盐及含卤素其它有机成主要用于生物碱、生物碱氢卤酸盐及含卤素其它有机成份含量测定。份含量测定。中药成分测定方法20/9220第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法3 3、配位滴定法、配位滴定法 包含包含EDTAEDTA法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测定鞣质、生物碱及含用以测定鞣质、生物碱及含Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+、Fe3+Fe3+、Hg2+Hg2+等矿物类制剂含量。如等矿物类制剂含量。如万氏牛黄清心丸等含万氏牛黄清心丸等含量测定就采取硫氰酸铵法；量测定就采取硫氰酸铵法；牛黄解毒片中石膏含牛黄解毒片中石膏含量测定。量测定。4 4、氧化还原滴定法、氧化还原滴定法 适合用于测定含有氧化还原性物质，如含酚类、适合用于测定含有氧化还原性物质，如含酚类、糖类及矿物药糖类及矿物药FeFe、AsAs等成份中药制剂。如等成份中药制剂。如磁朱丸磁朱丸中全铁含量测定采取铈量法；中全铁含量测定采取铈量法；牛黄解毒片中雄黄牛黄解毒片中雄黄含量测定；含量测定；丹皮酚注射液中丹皮酚含量测。丹皮酚注射液中丹皮酚含量测。中药成分测定方法21/9221第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法二、可见一紫外分光光度法二、可见一紫外分光光度法 该法是中药及其制剂含量测定一个惯用该法是中药及其制剂含量测定一个惯用方法方法,含有灵敏度高，精度好和操作简便等含有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。优点。该法要求被测成份本身或其显色产物对该法要求被测成份本身或其显色产物对可见可见紫外光含有选择性吸收。按测定波长紫外光含有选择性吸收。按测定波长数目不一样分为单波长光谱法和多波长光谱数目不一样分为单波长光谱法和多波长光谱法。法。中药成分测定方法22/9222第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法（一）单波长光谱法（一）单波长光谱法分类分类方法方法特点特点吸收系数法吸收系数法测定所配供试品溶液在要求波长吸收度，依据被测成份吸收系数（E1%1cm）计算其含量对仪器要求高，使用该法时，应注意仪器波长、空白吸收校正，吸收度准确度检定和杂散光检验无需对照品，方法简便对照品比较法对照品比较法在一样条件下配制对照品溶液和供试溶液，且使前者中所含被测成份量应为后者中被测成份量100%10%，用要求波测定二者吸收度，则可计算出供试品中被测成份浓度或含量对仪器要求较高对仪器要求较高标准曲线法标准曲线法配制一系列不一样浓度对照品溶液（常为5个），在相同条件下分别测定吸收度，绘制A-C曲线，或求出其回归直线方程（相关系数r0.999），即得标准曲线。在相同条件下，测定供试品溶液吸收度，就可求得供试品中被测成份浓度或含量。本法对仪器精度要求不高，有时标准曲线不经过原点，只要重现性好也可使用该法在比色法中最惯用中药成分测定方法23/9223第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法（二）多波长光谱法（计算分光光度法）（二）多波长光谱法（计算分光光度法）供试品溶液中若有各种（两种或两种以上）供试品溶液中若有各种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不一样程度重合组分共存，其紫外光谱彼此发生不一样程度重合时，则可经过测定各种波优点吸收度，依据吸收时，则可经过测定各种波优点吸收度，依据吸收度加和性，采取适当数学处理方式进行多组分同度加和性，采取适当数学处理方式进行多组分同时测定，或者用其排除共存组分干扰，测定其中时测定，或者用其排除共存组分干扰，测定其中某个组分。这就属于多波长光谱法范围。某个组分。这就属于多波长光谱法范围。下面简明介绍用多波长法测定存在光谱干扰下面简明介绍用多波长法测定存在光谱干扰多组分样品中某个组分一些技术：多组分样品中某个组分一些技术：双波长法（包双波长法（包含等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数含等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数光谱法和差示光谱法等。光谱法和差示光谱法等。中药成分测定方法24/9224第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知复杂优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知复杂样品，不过使用该法应慎重。样品，不过使用该法应慎重。首先因为中药及其制剂供试品溶液往往组成复杂，甚首先因为中药及其制剂供试品溶液往往组成复杂，甚至干扰组分或阴性空白样品变动性大，所以，使得其方法至干扰组分或阴性空白样品变动性大，所以，使得其方法适应性差，而只适应于同批样品或内控应用，当前极少在适应性差，而只适应于同批样品或内控应用，当前极少在药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量测定方药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量测定方法。法。再者，当测定吸收度处于吸收曲线陡峭部位时，波长再者，当测定吸收度处于吸收曲线陡峭部位时，波长微小变动可能对测定结果造成显著偶然误差。微小变动可能对测定结果造成显著偶然误差。还有在实际工作中，因为测试条件改变，仪器精度与还有在实际工作中，因为测试条件改变，仪器精度与性能限制，多波长法不用吸收系数法，而采取标准品对比性能限制，多波长法不用吸收系数法，而采取标准品对比方法（惯用标准曲线法）来进行样品测定。方法（惯用标准曲线法）来进行样品测定。中药成分测定方法25/9225第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法三、薄层扫描法三、薄层扫描法 薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱统计方法，薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱统计方法，又称薄层色谱扫描法（又称薄层色谱扫描法（TLCS），对应仪器称为），对应仪器称为薄层扫描仪（薄层扫描仪（Thin Layer Chromatogram Scanner）。）。薄层扫描法是用一定波长光照射在薄层板上，薄层扫描法是用一定波长光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光斑点，或经激对薄层色谱中吸收紫外光或可见光斑点，或经激发后能发射出荧光斑点进行扫描，将扫描得到图发后能发射出荧光斑点进行扫描，将扫描得到图谱及积分数据用于药品判别、杂质检验或含量测谱及积分数据用于药品判别、杂质检验或含量测定。定。中药成分测定方法26/9226第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法（一）基本原理（一）基本原理 薄层扫描法是指薄层色谱斑点色谱扫描，薄层扫描法是指薄层色谱斑点色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定定A-lA-l或或F-lF-l曲线。依据薄层扫描测定方式分曲线。依据薄层扫描测定方式分为为薄层吸收扫描法薄层吸收扫描法和和薄层荧光扫描法薄层荧光扫描法二种方二种方法。法。中药成分测定方法27/9227第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法1 1、薄层吸收扫描法、薄层吸收扫描法 基本原理：基本原理：Kubelka-MunkKubelka-Munk理论及曲线。因为薄层板存在理论及曲线。因为薄层板存在显著散射现象，斑点中物质浓度与吸光度关系需用显著散射现象，斑点中物质浓度与吸光度关系需用Kubelka-Kubelka-MunkMunk理论及曲线来描述。理论及曲线来描述。Kubelka-MunkKubelka-Munk理论以斑点相对理论以斑点相对反射反射率率和相对透光率计算薄层色谱斑点吸光度，说明了固定相散和相对透光率计算薄层色谱斑点吸光度，说明了固定相散射参数射参数SXSX对斑点中物质浓度与吸光度间关系影响，取得不一对斑点中物质浓度与吸光度间关系影响，取得不一样散射参数样散射参数SXSX时斑点时斑点A-KXA-KX理论曲线，即理论曲线，即Kubelka-MunkKubelka-Munk曲线。曲线。光源：钨灯和氘灯；光源：钨灯和氘灯；灵敏度：在灵敏度：在200-800nm200-800nm波长范围内选择适当波长进行测定，波长范围内选择适当波长进行测定，其灵敏度可达其灵敏度可达ngng级；级；适用范围：适合用于在可见、紫外区有吸收物质，及经适用范围：适合用于在可见、紫外区有吸收物质，及经过色谱前或色谱后衍生成上述化合物样品组分。过色谱前或色谱后衍生成上述化合物样品组分。中药成分测定方法28/92282 2、薄层荧光扫描法、薄层荧光扫描法 基本原理：基本原理：F=2.3KIF=2.3KI。ECLECL或或F=KCF=KC 光源：氙灯或汞灯。光源：氙灯或汞灯。灵敏度：最低可测到灵敏度：最低可测到10-50pg10-50pg。适用范围：适合于本身含有荧光或经过适当处理适用范围：适合于本身含有荧光或经过适当处理后可产生荧光物质测定。后可产生荧光物质测定。Kubelka-Munk Kubelka-Munk理论不适合用于薄层荧光扫描，无理论不适合用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组用斑点荧光强度积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分含量代替上式中分含量代替上式中F F与与C C 进行运算。进行运算。第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法中药成分测定方法29/9229（二）薄层色谱规范化操作（二）薄层色谱规范化操作1 1、仪器与材料、仪器与材料薄层板；薄层板；涂布器；涂布器；点样器材；点样器材；展开箱展开箱（层析缸）（层析缸）显色与检测仪器显色与检测仪器2 2、操作方法、操作方法薄层板制备；薄层板制备；点样；点样；展开；展开；检测；检测；第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法中药成分测定方法30/9230第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法（三）定量分析方法（三）定量分析方法1 1、方法学考查、方法学考查 新建薄层扫描定量方法必须进行方新建薄层扫描定量方法必须进行方法考查，以说明新建方法可靠性，考查法考查，以说明新建方法可靠性，考查内容有工作曲线、定量结果精密度及准内容有工作曲线、定量结果精密度及准确度、统计检验等内容。确度、统计检验等内容。中药成分测定方法31/9231（1 1）工作曲线）工作曲线 检验所选择散射参数检验所选择散射参数SXSX值是否适宜。值是否适宜。SXSX值适宜则工作值适宜则工作曲线被校直为直线，不然，调整曲线被校直为直线，不然，调整SXSX值再校正，直至在一定点值再校正，直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。样量范围内工作曲线成直线为止。考查工作曲线是否过原点，方便确定采取一点法或二考查工作曲线是否过原点，方便确定采取一点法或二点法定量。点法定量。确定点样量线性范围。既使采取曲线校直，也只是在确定点样量线性范围。既使采取曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，所以需确定点样量上、一定点样量范围内工作曲线为直线，所以需确定点样量上、下限。下限。为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品峰面积相靠近。峰面积相靠近。为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采取随行为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采取随行标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法中药成分测定方法32/9232第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法（2 2）精密度考查）精密度考查 取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点相同点样量平行点5 5点以上，展开后测定其峰点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（面积，求算相对标准差（RSDRSD），作为衡量定），作为衡量定量分析结果精密度指标。量分析结果精密度指标。RSDRSD应小于应小于4%4%。式中：为式中：为n n次测量平均值，次测量平均值，S S为标准差。为标准差。中药成分测定方法33/9233第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法（3 3）准确度考查）准确度考查 回收率是衡量定量方法准确度指标，惯用加回收率是衡量定量方法准确度指标，惯用加样回收率（样回收率（R R）来衡量，其值应在）来衡量，其值应在95-105%95-105%之间，之间，测量数据普通为测量数据普通为5-65-6个。个。将加入纯品试样溶液、供试品溶液及标准溶将加入纯品试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测定各斑点峰面积，计算各溶液中组分量，计算测定各斑点峰面积，计算各溶液中组分量，计算回收率（回收率（R R）。）。中药成分测定方法34/9234（4 4）统计检验）统计检验 统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量两组试验数据精密度或准确度（偶然误差或系统误差）两组试验数据精密度或准确度（偶然误差或系统误差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代替旧间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。方法或优于旧方法。统计检验包含统计检验包含F F检验与检验与t t检验。检验。F F检验检验即精密度差异检验，用以检验两组数据精密即精密度差异检验，用以检验两组数据精密度或偶然误差是否存在显著性差异，普通为单侧检验。度或偶然误差是否存在显著性差异，普通为单侧检验。t t检验检验即准确度差异检验，用以检验两组测量数据即准确度差异检验，用以检验两组测量数据平均值或系统误差是否存在显著性差异。若平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t t检验证实检验证实两种方法测得均值不存在显著性差异时，则新方法能够两种方法测得均值不存在显著性差异时，则新方法能够代替旧方法，代替旧方法，t t检验普通为双侧检验。检验普通为双侧检验。t t检验与检验与F F检验详细方法参见分析化学相关论著，此检验详细方法参见分析化学相关论著，此从略。从略。第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法中药成分测定方法35/9235第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法2 2、定量方法、定量方法 惯用定量方法有惯用定量方法有外标法外标法、内标法内标法、追加法追加法（叠加（叠加法）及法）及回归曲线回归曲线定量法。定量法。（1 1）外标法）外标法 外标法是薄层色谱扫描最惯用定量方法，方法简外标法是薄层色谱扫描最惯用定量方法，方法简便，但点样必须准确。便，但点样必须准确。外标一点法外标一点法 工作曲线经过原点（截距为零）时可用外标一点工作曲线经过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。只需点一个浓度标准品溶液，与供试液同板法定量。只需点一个浓度标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：C=FC=F1 1AA 式中：式中：C C为组分重量或浓度，为组分重量或浓度，A A为测得该组分峰面为测得该组分峰面积，积，F1F1为直线斜率或百分比常数。为直线斜率或百分比常数。中药成分测定方法36/9236外标二点法外标二点法 工作曲线不经过原点时，只能用外标二点法定量，工作曲线不经过原点时，只能用外标二点法定量，最少需点二种不一样浓度标准溶液（或一个浓度两种点最少需点二种不一样浓度标准溶液（或一个浓度两种点样量），才能决定一直线样量），才能决定一直线,其计算公式为：其计算公式为：C=FC=F1 1A+FA+F2 2 式中：式中：C C、A A同前，同前，F F1 1为直线斜率或百分比常数，为直线斜率或百分比常数，F F2 2为纵坐标截距，为纵坐标截距，F F1 1和和F F2 2值由仪器自动算出。值由仪器自动算出。外标一点法、二点法只是指用一个或二种浓度标准溶液对比定外标一点法、二点法只是指用一个或二种浓度标准溶液对比定量，为减小误差，同一薄板上量，为减小误差，同一薄板上供试品点样不得少于供试品点样不得少于4 4个个，对照品每对照品每一浓度不得少于一浓度不得少于2 2个个；并调整标淮溶液浓度或供试品与标准溶液点；并调整标淮溶液浓度或供试品与标准溶液点样量，使其峰面积相靠近；且点样量必须准确，宜用定量毛细管点样量，使其峰面积相靠近；且点样量必须准确，宜用定量毛细管点样样。第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法中药成分测定方法37/9237第三节第三节 惯用定量分析方法惯用定量分析方法（2 2）内标法）内标法 内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供