电化学发光检测技术原理ppt课件.ppt
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1、Elecsys Principle电化学发光检测原理及要点解读电化学发光检测原理及要点解读.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005标记免疫技术的发展标记免疫技术的发展标记免疫技术的发展标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光检测原理电化学发光检测原理电化学发光检测原理电化学发光的技术特点电化学发光的技术特点电化学发光的技术特点电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准概念及溯源性校准概念及溯源性校准概念及溯源性校准报警分析校准报警分析校准报警分析校准报警分析常见数据报警分析常见数据报警分析常见数
2、据报警分析常见数据报警分析试剂特性解读试剂特性解读试剂特性解读试剂特性解读检测菜单介绍检测菜单介绍检测菜单介绍检测菜单介绍主要内容主要内容.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005放免放免酶免酶免荧光免疫荧光免疫化学发光化学发光电化学发光电化学发光1960S197080S2000S1,抗体技术的革命,从使用多克隆抗体向使用单克隆抗体转变2,从手工操作向全自动分析仪的转变3,从液相放射免疫技术向均相和固相免疫分析技术的转变标记免疫技术的发展标记免疫技术的发展.cobasmodularplatformRo
3、cheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005缺点缺点半衰期短,试剂货架期短半衰期短,试剂货架期短 标记物不稳定标记物不稳定每次需做标准曲线每次需做标准曲线 反应时间长,反应时间长,不易自动化检测不易自动化检测 使用放射性核素,需要一定防护使用放射性核素,需要一定防护优点优点分子量小分子量小分子量小分子量小,免疫损耗小免疫损耗小免疫损耗小免疫损耗小简便简便简便简便、灵敏、特异、灵敏、特异、灵敏、特异、灵敏、特异可自行设计试剂盒可自行设计试剂盒可自行设计试剂盒可自行设计试剂盒应用范围广应用范围广应用范围广应用范围广 标记物:碘125标记免疫技术的发展放
4、射免疫测定法标记免疫技术的发展放射免疫测定法(RIA)底物:无需底物.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005 优势优势优势优势灵敏度较高灵敏度较高试剂稳定试剂稳定较快的速度较快的速度无污染无污染缺点缺点缺点缺点包被包被表面积小(灵敏度和速度)表面积小(灵敏度和速度)包被均一性不足(精密度)包被均一性不足(精密度)检测技术多为颜色反应(特异性和灵检测技术多为颜色反应(特异性和灵敏度)敏度)反应时间不一致反应时间不一致,造成结果的造成结果的偏差偏差(特别特别在手工操作时在手工操作时)标记免疫技术的发展酶
5、联免疫测定法标记免疫技术的发展酶联免疫测定法(ELISA)标记物:HRP辣根过氧化物酶/ALP碱性磷酸酶底物:TMB四甲基联苯胺/对硝基苯磷酸酯P-NPP.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005优势优势灵敏度较高灵敏度较高成本较低成本较低荧光检测信号荧光检测信号操作简便操作简便缺点缺点传统的微板吸附包被技术传统的微板吸附包被技术均一性差、均一性差、重复性差重复性差批量检测不能实现全自动批量检测不能实现全自动每次检测需要做定标曲线,每次检测需要做定标曲线,浪费成本浪费成本样本的前处理技术操作过程完全同
6、样本的前处理技术操作过程完全同样本的前处理技术操作过程完全同样本的前处理技术操作过程完全同ELISAELISA方法方法方法方法标记免疫技术的发展标记免疫技术的发展时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫(TRFIA)标记物:铕(Eu3+)、钐(Sm3+)等镧系元素底物:镧系元素螯合物.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005标记物:标记物:ALP 碱性磷酸酶底物:底物:MUP(4甲基伞形酮酰磷酸甲基伞形酮酰磷酸)激发物:光激发物:光最终检测信号:最终检测信号:荧光强度荧光强度代表产品:代表产品:代表产品:代表
7、产品:美国美国Abbott AXSYMAbbott AXSYM 法国bioMrieux VIDAS 标记免疫技术的发展标记免疫技术的发展酶荧光免疫酶荧光免疫测定法测定法(MEIA).cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005标记物:标记物:HRP 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶/ALP 碱性磷酸碱性磷酸酶酶发光底物:发光底物:鲁米洛鲁米洛、金刚烷金刚烷激发物:特定的化学环境激发物:特定的化学环境最终检测信号:最终检测信号:可见光可见光强度强度代表产品:代表产品:代表产品:代表产品:美国美国J&J Orth
8、o Vitros Eci美国美国BeckmanCoulter Access,Dxi800标记免疫技术的发展酶促化学发光标记免疫技术的发展酶促化学发光免疫免疫(CLIA).cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005标记物:标记物:吖啶酯,吖啶酯衍生物发光底物:无需底物发光底物:无需底物,标记物标记物直接发光直接发光激发物:特定的化学环境激发物:特定的化学环境最终检测信号:最终检测信号:可见光可见光强度强度代表产品:代表产品:代表产品:代表产品:德国德国SIEMENS Centaur XP 美国美国美国美国
9、Abbott I2000Abbott I2000 标记免疫技术的发展直接化学发光标记免疫技术的发展直接化学发光(CLIA).cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005标记物:标记物:三联吡啶钌三联吡啶钌发光底物:三丙胺发光底物:三丙胺激发物:激发物:直流电场直流电场最终检测信号:最终检测信号:可见光可见光强度强度代表产品:代表产品:代表产品:代表产品:罗氏公司罗氏公司 e411,E170,e601,e602e411,E170,e601,e602标记免疫技术的发展电化学发光标记免疫技术的发展电化学发光(E
10、CLIA).cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005标记免疫技术的发展标记免疫技术的发展标记免疫技术的发展标记免疫技术的发展电化学发光检测原理电化学发光检测原理电化学发光检测原理电化学发光检测原理电化学发光的技术特点电化学发光的技术特点电化学发光的技术特点电化学发光的技术特点校准概念及溯源性校准概念及溯源性校准概念及溯源性校准概念及溯源性校准报警分析校准报警分析校准报警分析校准报警分析常见数据报警分析常见数据报警分析常见数据报警分析常见数据报警分析试剂特性解读试剂特性解读试剂特性解读试剂特性解读检测菜
11、单介绍检测菜单介绍检测菜单介绍检测菜单介绍主要内容主要内容.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理-名称的由来名称的由来ELECTRO 电电 CHEMI 化学化学LUMINESCENCE 发光发光I MMUNO 免疫免疫ASSAY 分析分析.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005电化学发光免疫测定系统电化学发光免疫测定系统 Elecsys 电化学发光电化学发光
12、链霉亲和素链霉亲和素-生物素间接包被技术生物素间接包被技术 磁性微粒子固相载体磁性微粒子固相载体 检测系统检测系统电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理-技术特点技术特点.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005 专利的电化学发光技术专利的电化学发光技术标记物:三联吡啶 Ru(bpy)32+递电子体:三丙胺 TPA反应启动方式:直流电场电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理-电化学发光电化学发光.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel
13、,Version2.0,July2005里程碑式的标记物:三联吡啶钌里程碑式的标记物:三联吡啶钌u水溶性,分子量小u结构稳定,免疫损伤小,易于标记u应用广泛(激素,DNA等)u与三丙胺(Tripropylamine,TPA)共同构成电化学发光系统三联吡啶钌三联吡啶钌Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+NHS(N羟基琥珀酰胺酯羟基琥珀酰胺酯)电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理-标记物标记物.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005电极表面的电化学发光反应电极表面的电化学发光反应电化学发
14、光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理-电化学发光的反应过程电化学发光的反应过程发光标记物发光标记物:三联吡啶钌Ru(bpy)32+三联吡啶钌三联吡啶钌“催化”三丙胺三丙胺发出可见光可见光反应产物:三丙胺自由基三丙胺自由基(TPA*)+620nm的光子的光子发光底物:三丙胺(TPA)电化学发光启动条件电化学发光启动条件:直流电场直流电场反应特点:迅速迅速,可控可控,循环发光循环发光.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N
15、-CH2CH2CH3 失失e-CH2CH2CH3CH3CH2CH2-N-C-CH2CH3CH2CH2CH3失失 H+CH3CH2CH2-N-HCH2CH2CH3+CH3CH2CHO.+.H氧化Ru(bpy)33+激发态激发态Ru(bpy)32+基态基态Ru(bpy)32+还原电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理电化学发光的反应过程电化学发光的反应过程三丙胺阳离子三丙胺自由基三丙胺自由基-e-电极电极 失失e-+丙醛二丙胺.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005独独特特的的磁磁性性微微粒粒作作
16、为为固固相相载载体体u直径2.8um 表面的凸凹使包被面积放大u悬浮于反应体系中,形成均一稳定的液相,大大提高反应效能u磁性微珠易于通过磁场磁性吸引和分离电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理-固相载体固相载体显微镜下的磁微粒.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005专利的链霉亲和素生物素专利的链霉亲和素生物素系统系统电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理-链霉亲和素和生物素技术链霉亲和素和生物素技术SA链霉亲和素StreptoavidinSABBBBB生物素BiotinB生物素Bioti
17、nB生物素BiotinB生物素Biotin+=.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005适用于包被各种化合物,如多肽、脂多糖。适用于包被各种化合物,如多肽、脂多糖。SASA均匀牢固地包被在磁性微粒上均匀牢固地包被在磁性微粒上链霉亲和素链霉亲和素-生物素包被技术生物素包被技术Streptoavidin,SA Biotin,B B B衍生物衍生物结合结合的抗原或抗体的抗原或抗体与标本进行液相反应与标本进行液相反应电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理链霉亲和素和生物素技术链霉亲和素和生物素技术SA亲
18、和素磁性颗粒抗体B抗体生物素B生物素SA亲和素 磁性颗粒.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005ECL检测原理检测原理ElectroChemiLuminescence(ECL)电化学发光技术电化学发光技术结合结合Ruthenium结合结合磁珠磁珠转移至转移至电极电极;标标记后免疫记后免疫复合物与复合物与游离组分游离组分分离分离施加电压施加电压启动化学启动化学发光反应发光反应信号检测信号检测 e analyzer performance.cobasmodularplatformRocheDiagnos
19、tics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005ECL检测原理检测原理免疫复合物的形成Source:Roche Diagnostics Research and Development抗体抗体Ruthenium生物素生物素抗体抗体抗原抗原免疫复合物免疫复合物第一抗体标记生物第一抗体标记生物 素(与微磁珠结合)素(与微磁珠结合)第二抗体标记第二抗体标记RutheniumRuthenium(产生光信(产生光信号)号)两种抗体皆能与靶抗两种抗体皆能与靶抗原特异性结合原特异性结合.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Ve
20、rsion2.0,July2005电极电极工作电极磁铁光电倍增管TPATPATPATPA电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理测量室中的反应测量室中的反应1.使用清洗液使用清洗液(Clean Cell)清洁测量室清洁测量室2.移入磁铁移入磁铁,并使用并使用TPA清洁清洁测量室活化电极测量室活化电极3.反应复合物随反应复合物随TPA一起一起吸入吸入测量室测量室,4.工作电极工作电极加电加电压压,6.移开磁铁,移开磁铁,TPA冲走所有冲走所有反应物反应物。磁微粒被吸附磁微粒被吸附未结合到固相的未结合到固相的游离标记游离标记物被冲走物被冲走7.使用清洗液使用清洗液(Cleancell)清洁测量
21、室清洁测量室。5.电极表面反应后电极表面反应后发出光发出光子子,同时同时PMT检测光子信号检测光子信号.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005测量室组成和结构测量室组成和结构电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理测量室的结构测量室的结构v流动测量室v可升降的磁性分离系统v彻底的清洗系统v高度自动化.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理分析类型分析类型夹心
22、法夹心法竞争法桥联法桥联法.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理夹心法检测原理夹心法检测原理1.加入R1-生物素结合的抗体2.加入R2-Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+标记的的抗体3.加入待测样本,温育9min,形成双抗夹心复合物4.加入M-亲和素包被的磁微粒,温育9min,钌标记物通过待测样本和亲和素生物素连接到磁微粒上。5.反应复合物被吸入测量室进行磁性分离及其电化学发光测量。.cobasmodularplatformRocheDiagn
23、ostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005 夹心法夹心法 测定成正比正比:信号信号低低 =浓度浓度低低 信号信号高高 =浓度浓度高高 检测有多个结合位点的抗原如TSH,HCG,HBsAg,AFP等电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理夹心法检测原理夹心法检测原理 测定大分子抗原.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理竞争法检测原理竞争法检测原理1.加入R1-Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+标记的抗体2.加入
24、待测样本,温育9min,形成抗原抗体复合物。-3.加入R2-生物素标记的与样本同源的抗体。4.,加入M-亲和素包被的磁微粒;温育9min。未与待测抗原结合的钌标记物通过R2结合到磁微粒上5.反应复合物被吸入测量室进行磁性分离及其电化学发光测量。.cobasmodularplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005 竞争法竞争法 测定成反比:信号低=浓度高信号高=浓度低 检测仅一个结合位点的抗原等如FT3,E2,HBcAb等。测定小分子抗原电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理竞争法检测原理竞争法检测原理.cobasmodu
25、larplatformRocheDiagnostics,R.Ziergbel,Version2.0,July2005桥联法(桥联法(Bridging Principle)电化学发光免疫检测原理电化学发光免疫检测原理桥联法检测原理桥联法检测原理 理论基础:理论基础:单位单位IgGIgG分子具有分子具有2 2个个抗原结合位点抗原结合位点二聚体分泌型二聚体分泌型IgAIgA具有具有4 4个个抗原结合位点抗原结合位点五聚体五聚体IgMIgM可有可有1010个抗原结合位点个抗原结合位点检测相应的检测相应的IgG和和IgM抗体总量抗体总量。如。如HBcAb 测定成正比正比:信号信号低低 =浓度浓度低低 信
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