Western-blot-、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用-(最终版).ppt
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1、Western blot、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用湘雅医学院精神医学1301班2CONTENTS蛋白质蛋白质双向双向电电泳的原理泳的原理应用应用蛋白质蛋白质双向电双向电泳的方泳的方法法234Western blot原理原理及及方法方法13Western blot原理及方法蛋白质印迹法14Western blotting19751979同年最终Edward M.SouthernEdward M.Southern建立建立了将了将DNADNA转移到硝酸纤维转移到硝酸纤维素膜素膜 (NCNC膜)上,并利膜)上,并利用用DNADNARNARNA杂交检测特定杂交检测特定的的DNADNA片
2、段的方法片段的方法McMasterMcMaster和和CarmichaelCarmichael对对RNARNA进行印迹分析,发进行印迹分析,发明明 NorthernNorthern印迹技术印迹技术 George StarkGeorge Stark对电泳对电泳后的蛋白质分子进行后的蛋白质分子进行印迹分析从而发明印迹分析从而发明westernwestern印迹技术印迹技术 Western blotting!5 什么是蛋白蛋白质质印迹法印迹法?Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术,其核心在于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上,可分为电泳、转印、酶
3、免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性,是一种能用于分析样本组分的免疫学测定的方法。6 为什么要作蛋白什么要作蛋白质印迹印迹实验?2不同的样品中检查蛋白质的表达情况,上调或下调表达,如疾病和正常的样品之间的表达差异性1研究一些体外的蛋白质分子,寻找目的蛋白是否存在样品当中 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western Blot的基本原理的基本原理 蛋白蛋白样品的制品的制备SDS聚丙聚丙烯酰胺
4、凝胶胺凝胶电泳泳转膜膜封封闭一抗孵育一抗孵育二抗孵育二抗孵育底物底物显色色 Western Blotting 操作流程操作流程9 第一步转 膜 第三步一抗杂交 第五步底物显色 第四步二抗杂交 第二步封 闭 Western Blotting 操作流程操作流程n n优点优点:n n1.1.快速(一种抗体)快速(一种抗体)n n2.2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条没有二抗交叉反应引起的非特异性条带带n n缺点缺点:n n1.1.免疫反应性降低免疫反应性降低n n2.2.无信号二级放大无信号二级放大n n3.3.抗体标记费时昂贵抗体标记费时昂贵,使用不方便使用不方便 WesternBlotting
5、WesternBlotting方法一方法一:直接法直接法n n优点优点:n n1.1.免疫特异性不受标记影响免疫特异性不受标记影响n n2.2.信号放大灵敏度高(多个二抗结合位点)信号放大灵敏度高(多个二抗结合位点)n n3.3.多种标记的二抗可供选择多种标记的二抗可供选择n n4.4.可选择不同的可选择不同的MarkerMarkern n缺点缺点:n n1.1.交叉反应引起的非特异性条带交叉反应引起的非特异性条带n n2.2.额外的二抗孵育以及条件优化额外的二抗孵育以及条件优化 WesternBlottingWesternBlotting方法二方法二:间接法接法n n直接法与用二抗的间接法相
6、比有诸多不足,标记可用于很多直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足,标记可用于很多种不同特异性的一抗,避免了标记很多一抗的需要,同时因种不同特异性的一抗,避免了标记很多一抗的需要,同时因为一抗结合不知一个二抗分子,所以二抗可以增强信号,所为一抗结合不知一个二抗分子,所以二抗可以增强信号,所以一般情况下都采用间接法进行检测以一般情况下都采用间接法进行检测 为什么一般情况下都采用间接法进行检测?WesternBlottingWesternBlotting间接法操作流程接法操作流程分子量标准显色结果抗体膜的选择 WesternBlottingWesternBlotting设计标准准15 不可小看不可小
7、看“蛋白蛋白标准准”-”-分子量分子量标准的准的选择分子量标准预混分子预混分子量标准量标准修饰分子修饰分子量标准量标准预染分子预染分子量标准量标准n n预混分子量标准预混分子量标准高分子量高分子量标标准准低分子量低分子量标标准准宽宽分子量分子量标标准准n n预染分子量标准预染分子量标准单单色色预预染染多色多色预预染染n n修饰分子量标准修饰分子量标准 糖基化糖基化 磷酸化磷酸化 荧荧光光标记标记 不可小看不可小看“蛋白蛋白标准准”-”-分子量分子量标准的准的选择n n高分子量标准n n低分子量标准n n宽分子量标准 预混分子量混分子量标准准n n单色预染n n多色预染 预染分子量染分子量标准准
8、n n糖基化n n磷酸化n n荧光标记 修修饰分子量分子量标准准价格便宜,价格便宜,简单快速封快速封闭与非特与非特异性抗体异性抗体结1.1.硝酸硝酸纤维素膜(素膜(NC膜)膜)灵敏度、分辨灵敏度、分辨率和蛋白率和蛋白亲和和力比常力比常规的膜的膜要高,要高,对蛋白蛋白的吸附能力要的吸附能力要远远大于大于NC膜膜2.PVDF2.PVDF膜膜对核酸和蛋白对核酸和蛋白质具有很强的质具有很强的结合能力结合能力,能,能代替代替NCNC膜用于膜用于分子印迹和杂分子印迹和杂交实验交实验。3.3.尼尼龙膜膜 膜膜 三种三种选择 选择标准选择标准1.1.膜与目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜能膜与目的蛋白
9、分子的结合能力(也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量),以及膜的孔径(也就是拦截蛋白的大结合蛋白的载量),以及膜的孔径(也就是拦截蛋白的大小)小)2.2.不影响后续的显色检测(也就是适和用于所选的显色方不影响后续的显色检测(也就是适和用于所选的显色方法,信噪比好)法,信噪比好)3.3.后继实验有其他要求,比如要做蛋白测序或者质谱分析,后继实验有其他要求,比如要做蛋白测序或者质谱分析,还要根据不同目的来挑选不同的转移膜还要根据不同目的来挑选不同的转移膜 选择膜的标准 膜的特点n n作为作为westernwestern来讲,理论上单抗比多抗的特异性要好,但单抗种类较来讲,理论上单抗比多抗的特异性要好
10、,但单抗种类较少一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。少一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。用于用于用于用于westernwesternwesternwestern的抗体和的抗体和的抗体和的抗体和用于用于用于用于ELISAELISAELISAELISA的抗体,一般来说用于的抗体,一般来说用于的抗体,一般来说用于的抗体,一般来说用于westernwesternwesternwestern的抗体识别的是氨基酸序列的抗体识别的是氨基酸序列的抗体识别的是氨基酸序列的抗体识别的是氨基酸序列特异性;而可用于特异性;而可用于特异性;而可用于特异性;而可用于ELISAELISAELISAELISA的抗体则要
11、看抗原种类,有些是识别氨基酸的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构像特异性序列特异性,有些是识别构像特异性序列特异性,有些是识别构像特异性序列特异性,有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确。所以一般根据抗体说明书来确定。定。n n做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜
12、上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带交叉反应条带交叉反应条带交叉反应条带。抗体的选择方便、便宜、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测化学显色法化学显色法灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短同位素法同位素法灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测化学发光法化学发光法Krypton Krypton 荧光底物荧光底物法荧光底物法显色的显色的方法方
13、法玩转大学PPT素材 更多好素材请访问 http:/ 25蛋白质双向电泳的原理Enter your subtitle here226 双向电泳的实验原理第一向:等电聚焦第二向:SDSPAGE电泳第一向:等电聚焦n n聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)(Arc)和交联剂和交联剂N,N-N,N-甲叉丙甲叉丙烯酰胺烯酰胺(Bis)(Bis)在加速剂在加速剂N,N,NN,N,N四甲基乙二胺(四甲基乙二胺(TEMEDTEMED)和催化剂硫酸铵(和催化剂硫酸铵(APAP)或核黄素的作用下聚合交联成三维)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为网状的凝
14、胶,以此凝胶为支持物的电泳称为PAGEPAGE。第二向:第二向:SDSPAGESDSPAGE电泳泳3031蛋白质双向电泳的方法Enter your subtitle here332技术流程双向电泳(2DE/DIGE)实验组和对照组样品制备提出生物学问题凝胶图像分析差异蛋白点选取蛋白酶解及质谱分析差异蛋白点的成功鉴定生物学问题的解释n n目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术n n能实现多达能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析种不同蛋白质进行分离分析双向双向电泳泳(2DE/DIGE)等电聚焦,实现蛋白质按等电点进行分离分子量大小通过双向电泳使得不同等
15、电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离SDS-PAGE分离,使得蛋白质按分子量大小排序 双向电泳(2DE)示意图硝酸银染色图谱考马斯亮蓝染色图谱 2DE图谱将标记的样品混合双向电泳分离荧光扫描仪扫描图像重叠分析样品1:Cy3标记 双向电泳(DIGE)示意图 DIGE图谱n n双向电泳的最关键步骤之一双向电泳的最关键步骤之一n n制备原则:尽可能多地提取出总蛋白质,尽可能简单的制备原则:尽可能多地提取出总蛋白质,尽可能简单的操作步骤,注意防止样品提取过程中的各种化学修饰,操作步骤,注意防止样品提取过程中的各种化学修饰,去除样品中核酸、盐离子等干扰物质去除样
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