DB4201T520-2017两系杂交水稻品种纯度SSR鉴定方法.docx
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1、ICS 65.020.20B 22DB4201武汉市地方标准DB4201/T 5202017两系杂交水稻品种纯度 SSR 鉴定方法2017-06-20 发布2017-07-20 实施武汉市质量技术监督局 发 布DB4201/T 520-2017前言本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由武汉市农业委员会归口。本标准起草单位:中垦锦绣华农武汉科技有限公司、武汉市农业技术推广中心。 本标准主要起草人:徐姮、许树文、昌华敏、熊恒多、李晏斌、刘万里、万元香。本标准首次发布。IDB4201/T 520-2017两系杂交水稻品种纯度SSR 鉴定方法1 范围本标准规定了用SSR分析技术
2、进行两系杂交水稻品种纯度鉴定的原理、仪器设备及试剂、相关试剂及溶液配制、推荐引物、操作程序、统计与计算的方法。本标准适用于两系杂交水稻品种纯度的快速鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定GB 4404.1-2008 粮食作物种子 第1部分:禾谷类GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3、3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1引物一条互补结合在模板DNA链上的短的单链,提供3-OH末端作DNA合成的起点,延伸合成模版DNA的互补链。3.2SSR 标记简单序列重复标记由几个核苷酸(一般为2 个6 个)为重复单元的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列;由于基本单元重复次数的不同,而形成SSR座位的多态性;根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异引物来扩增SSR序列即可揭示其多态性。3.3推荐引物品种纯度鉴定中优先选用的一套SSR引物,其检测位点多态性高,检测结果重复性好。3.4聚合酶链式反应14 原 理品种的不同本质上是由于其遗传物质DNA核苷酸序列的不同所致,利用
4、不同品种其SSR多态性存在差异的特点达到纯度鉴定目的。简单重复序列(SSR)分布于水稻整个基因组的不同位置上,不同品种每个位点上重复单位的数目及序列可能不同,因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列,因而可根据其两端的序列设计一对特异引物,利用PCR技术对重复序列进行扩增,扩增产物通过电泳进行分离,在凝胶成像系统上观察可辨别SSR电泳谱带。通过选用亲本间具有多态性的SSR引物在杂交种中PCR扩增产物电泳谱带差异,鉴定两系水稻品种纯度。5 仪器设备及试剂见附录A。6 相关试剂及溶液配制见附录B。所用试剂均为分析纯。试剂配制用水均应符合GB/T 6682的一级水
5、的要求。7 推荐引物见附录C,其它在本文件中未推荐的亲本间多态性引物也可以使用。8 操作程序8.1 样品制备8.1.1 受检样品的扦样、分样和保存,应符合 GB/T 3543.2 的要求。8.1.2 试样的数量及淘汰值可参考 GB/T 3543.5 要求。检测时将其双亲的标准种子设为对照。8.2 样品 DNA 提取8.2.1 材料准备8.2.1.1 亲本2每个亲本取20个单株叶片取等量组织混合制取样品,提供的亲本种子应符合GB 4404.1的原种纯度要求。8.2.1.2 杂交种每个样品取200 粒以上的种子,培养幼苗单株制样应符合GB/T 3543.4要求。8.2.2 DNA 提取8.2.2.
6、1 亲本 DNA 的提取按GB/T 3543.4要求的方法培养幼苗取水稻叶片2 cm放入研钵中,加液氮充分研磨至粉末状,然后移入2 ml离心管中,加入500 ul预热(60 )的DNA提取液,65 水浴30 min,间隔15分钟颠倒混匀一次,再加入500 ul氯仿-异戊醇(24:1),轻轻混匀。10 000 rpm离心5 min。将上清液400 ul转入另一支含有800 ul -20 预冷乙醇的离心管沉淀DNA,10 000 rpm离心10 min,弃上清液,再用70乙醇溶液洗涤2 遍,自然条件下干燥后,加入200 ul超纯水溶解DNA,检测浓度,将DNA稀释至20 ng/ul,-20保存留用
7、。8.2.2.2 杂交种 DNA 的提取按GB/T 3543.4要求的方法培养幼苗取水稻叶片2 cm剪碎移入PCR板单孔内,每个单孔加入BufferA 50 ul,然后将加有样品和BufferA的PCR板放入95 水浴15 min,然后每个单孔加入50 ul BufferB, 混匀离心,取2 ul上清作为样品DNA。要求的DNA提取方法都适用于本标准。8.3 PCR 扩增8.3.1 引物选择首先选择附录C中的引物在亲本中进行扩增,挑选出亲本间检测出差异的引物用于杂交种纯度检测, 杂交种纯度检测时加入2个亲本作为对照。8.3.2 反应体系20 ul的反应体系,2 ul样品DNA,1 ul正向引物
8、(10 umol/L),1 ul反向引物(10 umol/L),0.2 ul TaqDNA聚合酶(5 U/ul),0.2 ul dNTP(10 mM/L),2ul PCR缓冲液(10,pH8.3),13.6 ul超纯水。8.3.3 反应程序94 预变性5 min,一次循环:94 变性30 s,55 退火30 s,72 延伸30 s;运行35 个循环,72 延伸5 min,4 保存。8.4 PCR 产物检测8.4.1 琼脂糖凝胶制备将1TAE电泳缓冲液和琼脂糖(2.5浓度)混合煮沸融化,冷却至50 55 ,加入EB(或EB 替代物),使其最终浓度约为0.5 g/ml,适时倒入制胶平台上,待胶凝固
9、后拔出梳子。8.4.2 电泳3注:以上为推荐用于水稻纯度鉴定的DNA快速提取方法,样品DNA即取即用,不宜留存;其他能够达到PCR扩增质量DB4201/T 520-2017将制好的凝胶放入加入TAE缓冲液的电泳槽中(缓冲液应高于凝胶表面),清除加样孔气泡和杂质, 向加样孔中加入8 ul混有溴酚蓝的PCR产物,接通电源在5 V/CM凝胶的电压下进行电泳,至指示剂(溴酚蓝)接近胶板底部时,结束电泳。8.4.3 拍照记录将胶板放入凝胶成像系统进行拍照,记录结果并保存。9 统计与计算如果SSR位点表现双亲带型,则说明品种为真杂种;如果出现单个亲本带型或其他带型,则该种子(幼苗、株)为假杂种。品种纯度(
10、P)的数值以百分数表示,按公式(1)计算:P = N1 - N2 100%N1(1)式中:P品种纯度; N1检测种子数;N2非双亲带型的种子数。4附 录 A(资料性附录) 仪器设备及试剂A.1 仪器设备包括但不限于:PCR 扩增仪;电泳仪;水平电泳槽及配套的制胶附件;凝胶成像系统;高速冷冻离心机;水平摇床;磁力搅拌计;微波炉;高压灭菌锅;紫外分光光度计;移液器:规格分别为 10ul、20ul、100ul、200ul、1 000ul 连续可调;酸度计;电子天平;检验砻谷机。A.2 试剂包括但不限于:吐温 20(W/V);氢氧化钠;三羟甲基氨基甲烷;氯仿;异戊醇;浓盐酸;冰醋酸;蔗糖;溴酚蓝粉末;
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